目前ES细胞的培养多采用DMEM适合于生长速度快、贴壁性差的细胞培养。一般来说早期胚胎的培养以高糖DMEM更适宜;而ES细胞的培养传代过程中对葡萄糖含量的要求则相对较低，可用低糖DMEM。除DMEM培养基外，在ES细胞的分离培养中也有人采用TCM-199和F12等。TCM-199是根据哺乳动物细胞的特点改良的199液，适合于多种哺乳动物细胞的培养;F12培养基比较适合单细胞和克隆化细胞的培养，在ES细胞的分离培养中经常与DMEM 联合使用。上述是指在有饲养层存在的条件下所采用的基本培养液。除此之外人们为了消除饲养层细胞的干扰，使ES细胞免受致癌剂丝裂霉素C的毒害作用，而采用条件培养基(conditioned medium，CM)来进行ES细胞的培养，这就要求所用的CM具有促进 ES 细胞增殖和抑制 ES细胞分化的双重功能。Smith和Hopper(1983年)首次使用肝细胞条件培养基(BRL-CM)建立了小鼠ES细胞系，并发现该条件培养基中含有一种分化抑制剂即LIFBRL-CM。它的制备方法如下:将BRL细胞从大鼠肝脏中分离出来后在培养板上培养，待细胞贴壁后加入30mL培养基，该培养基的组成为Eagle’s Medium+非必需氨基酸如谷氨酸(1-Glu)、天冬酰胺(L-Asn)、天冬氨酸(L-Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(L-Ala)+0.1 mmol/L 2-巯基乙醇+0.1 mmol/L丙酮酸钠+10%胎牛血清。37℃，5%CO₂及饱和温度的条件下培养，每3d收集1次培养液，每个大鼠肝细胞饲养层可用21d即可收集7次培养液。使用该培养液之前为去除杂细胞和所含杂质应用滤器过滤。另据研究，BRL-CM中还含有胰岛素和转移生长因子。尽管目前采用条件培养基在ES细胞的培养上取得了一定成绩，但由于其不适合ES细胞长期传代中的使用，而且因为动物种类的不同所需的条件培养基也需要进行仔细筛选。筛选工作琐碎复杂因而限制了CM在ES细胞培养中的使用。由于使用条件培养基培养ES细胞所获得的类ES细胞在生长状态上与常规所见不同，且ES细胞增殖速度太快，因此对该类ES细胞目前还难下定论。现在生产条件培养基的常见细胞有BRLHBC(human bladder carcinoma cell line 5637，人膀胱癌细胞株5637)，PSA-1(一种小鼠胚胎细胞)PCIO-6R(LF转染的COS细胞)，T2细胞(一种小鼠胚胎细胞)，P19PMF和PLH等(Martin，1981;Williams，1988；Smith,1988;Piedrahita, 1990;Graves ,1993;Strelchenko,1993;Meinecke-Till-mann，1996)