离散后的ICM 在饲养层上有足够满足其生长增殖需要的培养基存在情况下，小鼠一般23d就会形成一个ES细胞集落这就要求定时传代，否则ES细胞就会分化和变异。传代时应挑取充分增殖而又未分化的集落，用消化液同时辅以玻璃针剥离，使其又一次离散接种于新鲜饲养层上。ES细胞具有无限增殖传代的特性但由于培养条件的不完善或其他可能原因，目前，除小鼠外其他动物的ES细胞都较难无限传代下去。目前发现ES细胞各代之间，随代数的增加克隆数存在一定的递减穎规律，这也是限制ES细胞真正走向生产实践的障碍。一方面为了促进ES细胞的分裂增殖，另一方面又要抑制ES细胞的分化，为了解决这一矛盾人们除应用经过灭活的饲养层细胞外，还常在基础培养液中添加一些细胞因子(cytokines)。细胞因子是主要由免疫细胞受抗原或丝裂原刺激后分泌产生的激素样蛋白质，具有调节细胞功能的作用。在ES细胞培养传代过程中常用的细胞因子有:白细胞抑制因子(leucocyte inhibitory factor, LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic-fibro-blast growth factor，b-FCF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF);千细胞因子(stem cell factor，SCF，又称肥大细胞生长因子)、胰岛素样生长因子-1(insulin -like growth factor-1,IGF-1)、一种双萜类物质(forskolin)等等。LIF是目前研究最多应用最广泛的一种ES细胞分化抑制因子，活化的T细胞、单核细胞、神经胶质细胞等均能表达LIF，LIF分为D型(分泌型)和M型(基质型)两种，除LIF外，上述的各因子均是促进ES 细胞生长增殖的。

        ES细胞像其他细胞一样可以在体外冻存，ES细胞冷冻保存方法与普通培养细胞冻存方法基本相同，但需要注意的是在ES细胞的冷冻过程中一般都要求与饲养层成纤维细胞一并冷冻，以便提高解冻后的存活率和再形成克隆集落的能力。常用冷冻液为80% DMEM+10% NBS+10% DMSO，常用解冻液为BSA 0.2g+蔗糖1.71 g，用50 m 无钙镁 PBS 定容。