概述

        牙髓干细胞(dental pulp stem cells ,DPSCs)属于成体干细胞，具有自我更新能力、分化潜能以及克隆形成能力。牙髓中含有未分化的间充质细胞，有人认为这种细胞可能就是牙髓干细胞，但尚未得到证实。目前，有关牙髓干细胞的研究仍不多。

用品

        (1)条件培养液：DMEM，含10%~20% FBS。

        (2)0.25%胰蛋白酶、3 mg/mL I型胶原酶、4 mg/mL dispase。

        (3)Hanks 液。

        (4)手术刀、弯钳、眼科剪、1mL注射器、手术弯盘、青霉素小瓶、细胞计数板。

步骤

        (1)取正常19~29岁成人第三磨牙Hanks液冲洗牙齿表面，并将附着组织去除，在釉牙骨质结合处用牙科裂钻将牙齿切断暴露牙髓腔，小心将牙髓取出。

        (2)用3mg/mL I 型胶原酶-Hanks液和4mg/mL dispase-Hanks 液消化牙髓组织37℃、1h，过70μm 滤网得到单细胞悬液。

        (3)DMEM洗细胞2遍，细胞计数。

        (4)以1x10³/mL细胞密度接种于35 mm塑料培养皿中。37℃、5% CO₂饱和湿度恒温箱中培养。

        (5)7d后挑取形成的克隆，扩大培养。

操作提示

        与MSCs类似，牙髓干细胞应以低密度培养以保持其多能性。

结果及鉴定

        获得的细胞可传代培养。目前尚无有效的、特异性鉴别标志，其特性与骨髓间充质于细胞有许多相似之处。牙髓干细胞特殊的选择培养模式尚未见报道。

        (1)形态学：牙髓干细胞形态上与牙髓成纤维细胞相似。

        (2)牙本质唾磷蛋白不在牙髓干细胞中表达。

        (3)牙髓干细胞中碱性磷酸酶活性较低。

        (4)牙髓干细胞克隆形成率约为(2.2~7.0)x10²/10³细胞，其中只有约20%的克隆可以扩增传代超过20代。

        (5)牙髓干细胞中Nestin，GFAP表达阳性。

        ++：强阳性；+：弱阳性；-：阴性；VCAM-1：血管细胞黏附分子1；MyoD：肌细胞起源；α-SM actin：α-平滑肌肌动蛋白；MUC-18：一种细胞黏附分子；BSP：骨唾液酸蛋白；Alk Phos：碱性磷酸酶；PPARg：过氧化物酶体增殖物激活受体Y；FCF-2：成纤维细胞生长因子