概述

        神经干细胞(neuralstem cells，NSC)的研究已有10多年历史，人们已成功从多种哺乳动物胚胎和成体中枢神经系统中分离出神经干细胞。神经干细胞的研究打破了中枢神经系统不能修复的传统观念为中枢神经系统疾病的治疗展现了广阔的应用前景。

用品

        (1)条件培养液：DMEM/F12=1：1、20ng/mL bFGF、100 μg/mL胰岛素。

        (2)0.25%胰蛋白酶。

        (3)D-Hanks 液：NaCl 8 g、KCI 0.4 g、Na₂HPO₄·H₂O 0.06 g、KH₂PO₄ 0.35 g、酚磺酞0.02g，加水1000 mL溶解，调pH 值为7.2~7.4，高压灭菌,4 ℃储存。

        (4)手术刀、弯钳、眼科剪、1mL注射器、手术弯盘、青霉素小瓶、细胞计数板。

步骤

        (1)取2周龄Wistar孕鼠1只，断颈处死，70%乙醇消毒5min，剪开腹部皮肤及打开腹腔，切取子宫，转入无菌90mm培养皿中。

        (2)眼科剪从子宫角处取出胎鼠,D-Hanks液冲洗，置冰台上，用眼科剪剪开头骨，小心将脑组织移入另一无菌90mm培养皿中，D-Hanks液冲洗。

        (3)去除脑膜及血管，用手术刀反复切割脑组织，过200目筛，制成单细胞悬液。

        (4)细胞计数，以1x10⁶/mL细胞密度接种于90mm塑料培养皿中，加入条件培养基，37℃、5%CO₂、饱和湿度恒温箱中培养。

操作提示

        (1)该方法是成体神经干细胞的获取方法，其在体外增殖需要在促有丝分裂因子(如FCF-2和ECF)存在。去除有丝分裂因子或加人其他促进分化的细胞因子，能够诱导神经干细胞分化。

        (2)传代培养：神经干细胞的生长特点是悬浮生长，增殖力强，6~7d传一代。一般一瓶细胞传成3瓶培养。传代的操作细节及注意事项与悬浮细胞的传代相同。

        (3)神经干细胞的冻存和复苏与正常细胞的操作流程相同。

结果及鉴定

        培养24h后，可见细胞数较少的细胞克隆形成，7d时，每个细胞集落可含上百个细胞，呈桑甚状，悬浮生长。鉴定方法如下。

        (1)巢素(nestin)免疫组化检测：细胞集落接种到预先用1%赖氨酸处理过的小玻片上，培养48h后用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2遍后移到37℃烤箱烤干。0.3%Triton-X100和0.3%H,0,常规处理30min，PBS洗3遍，1%BSA处理30min，滴加Nestin抗体4℃孵育过夜，SABC试剂盒检测。

        (2)5%胎牛血清诱导细胞集落分化：细胞集落接种到6孔板中预先用1%赖氨酸处理过的玻片上，倒置显微镜下观察细胞形态，发现细胞体积变大，有多个突起有的突起很长，呈轴突样。培养7~10d后收集玻片，4%多聚甲醛固定 30min，备用。

        (3)NF-200、CFAP、Ge免疫组化细胞：将(2)中收集的细胞爬片用0.3% Triton-X100和0.3% H₂O₂常规处理30min，PBS洗3遍，1%BSA处理30min，分别滴加NF-200、GFAPGc抗体，4℃孵育过夜，SABC试剂盒检测。NF-200阳性细胞为神经元，体积小，突起较长。CFAP阳性细胞为星形胶质细胞，细胞体积较大，突起较多。Gc阳性细胞为少突胶质细胞，细胞在集落中最小，树突很少。