概述

        早在20世纪70年代中期，人们已经证实在哺乳动物的骨髓基质中，存在具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，称之为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)。在骨髓中除了骨髓间充质干细胞外，还存在着大量的血细胞，少量的单核粒细胞、造血干细胞及前体血细胞。骨髓间充质干细胞较易获得，可以分化为多种组织细胞，分离培养较容易，使其在组织器官缺损性疾病、组织器官退行性疾病、某些遗传性疾病及恶性肿瘤(特别是造血系统恶性肿瘤)的治疗以及基因治疗和组织工程领域具有重要的应用前景。。

用品

        (1)培养基：DMEM或IMEM或α-MEM(低糖，Gibco)、10%~20%胎牛血清(FBS)、0.2mmol/L谷氨酰胺、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL。

        (2)细胞消化液：0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA。

        (3)5x磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl 40.0g、Na₂HPO₄·12H₂O 7.16 g、KCI 1.0 g、KH₂PO₄ 1.0g，加水定容至1 000 mL，高压灭菌。

        (4)100x谷氨酰胺(20mmol/L)：1.46g谷氨酰胺溶入50mL 双蒸水中，过滤除菌，-20℃储存。

        (5)10x氯化钠溶液：氯化钠9g溶于100mL双蒸水中，高压灭菌20min。

        (6)Pereoll储存液：10xNaCl溶液1 mL、Percoll 9mL，混匀，4 ℃储存。

        (7)条件培养基：DMEM或IMEM或α-MEM(低糖，Gibco)、2% FBS、0.2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素100 U/mL链霉素100 μg/mL、LIF1000U/mL、Na₂SeO₃ 0.1 μmol/L、ß-基乙醇0.1 mmol/L、IGF10 ng/mL、必需氨基酸1%。

        (8)常规原代细胞培养器具。

MSCs的分离培养

(1)全血贴壁培养法

        ①4周龄雄性BABL/c小鼠2只，断颈处死，70%乙醇消毒20~30min，取股骨和胫骨，去除骨上附着的软组织和骨骺端。

        ②将分离出的股骨和胫骨移入另一无菌平皿，用针管抽5mL PBS将骨髓冲出，用200目滤纱过滤，1500r/min离心4 min。

        ③将沉淀的细胞重悬于10mL培养液中，2x10⁶个接种于塑料90mm培养中。

        ④接种后24~48h换液，也有报道延长首次换液时间有利于干细胞的贴壁和增殖(不贴壁细胞分泌的细胞因子可能对于贴壁细胞的生长有促进作用)，最长可以7d首次换液。

        ⑤首次换液后，每3~4d换液1次，7~14d首次传代。

        ⑥将已70%~80%长满的细胞用消化液消化，分散成单细胞，以1x10⁶/mI细胞密度接种于90mm塑料培养皿中。每3~4d换液1次，7~10d传代。

(2)细胞密度梯度分离(Percoll液法)

        ①取4周龄雄性BABL/c小鼠2只的股骨和胫骨，去除骨上附着的软组织和骨骺端，将骨髓冲出，制成单细胞悬液

        ②在一无菌离心管中，加入0.3mL Percoll液和0.7mL PBS，混匀配制成密度为1.073 g/cm³(或1.077 g/cm³ Ficoll )的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液上部，3000r/min离心30 min，去除上清。

        ③PBS洗2次。细胞密度梯度分离法接种的细胞经台盼蓝染色，活细胞率大于99%。按2x10⁵/cm²细胞密度接种细胞于塑料培养瓶或90mm塑料培养皿中。

        ④接种后72h换液，以后每3~4d换液，7~10d首次传代。

        ⑤用0.25%胰酶和 0.02% EDTA 将细胞消化下来，以1x10⁶/mL 细胞密度接种于90mm塑料培养皿中，每3~4d换液1次，7~10d传代。

MSCs的纯化

        (1)亚克隆纯化细胞

        ①取1~2代细胞，用消化液将细胞分散成单细胞，接种96孔培养板中，每孔1个。37 ℃、5%CO₂、饱和湿度恒温箱中培养。

        ②14d以后观察有细胞克隆的孔并进行标记。待细胞长到70%~80%铺满时，进行扩传，培养液用条件培养基，以保持骨髓间充质干细胞的未分化状态。

(2)磁珠纯化细胞

        ①取1~2代细胞，用消化液将细胞分散成单细胞。

        ②在细胞上进行 Terll9 磁珠标记，并上磁架，收集上清中的细胞，重悬为单细胞悬液

        ③ 在细胞上进行 CD45 磁珠标记，并上磁架，收集上清中的细胞，流式细胞仪(FCM)测定细胞纯度。

        ④细胞计数，以1x10'/mL 细胞密度接种于90mm塑料培养皿中，3~4d换液1次。

(3)FCM分选(sorting)细胞

        ①取1~2代细胞，用消化液将细胞分散成单细胞。

        ②在细胞上进行第一个特异性抗体标记，在流式细胞仪上收集分选出细胞，重悬为单细胞悬液。

        ③在细胞上进行其他特异性抗体标记，用流式细胞仪收集分选出细胞。

        ④细胞计数，以1x10⁶/mL细胞密度接种于90mm塑料培养皿中，3~4d换液1次。

操作提示

        MSCs应以低密度培养以保持其多能性，MSCs融合后很快变成缓慢增殖细胞，丧失克隆形成能力和分化的潜能，

结果及鉴定

        骨髓间充质干细胞分离纯化困难，在其表面尚未发现特异性标志物。

        (1)形态学观察：骨髓间充质干细胞通常被认为是一类体积大、核浆比例不大、呈纺锤形或梭形的细胞，贴壁牢，不易消化。

        (2)细胞周期：在体外培养体系中，细胞倍增时间约为30h.

        (3)FCM检测：骨髓间充质干细胞表面一般不表达造血干细胞的特异性标志。

        (4)碱性磷酸酶染色(AKP)：应为阳性。

        (5)诱导分化实验：在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化成为成骨细胞、神经细胞、上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等多种细胞。

        (6)von Kossa染色：细胞经成骨细胞诱导液培养14~24d后，用甲醇在-20℃固定2min，PBS洗2遍，2%硝酸银在60W灯泡照射下处理1h时。水洗，再用2.5%硫代硫酸钠固定5min，水洗，1%核固红复染。光镜下可见黑色钙盐沉积。