01 原理

        Western Blot（蛋白质免疫印迹法）是一种常用于科研中的蛋白质分离和鉴定技术。通过该技术，将混合的蛋白质样品依据分子量（即蛋白质类型）进行凝胶电泳分离。分离后的结果会转移到膜上，在每个蛋白质上形成对应的条带。然后，通过将特定的抗体与膜上的蛋白质反应，未结合的抗体会被洗去，只留下结合到目标蛋白质上的抗体。通过显影膜，可以检测到这些结合的抗体。

        由于抗体只与目标蛋白结合，因此在膜上只会看到一条条带。条带的厚度与蛋白质的含量成正比，借助标准品可以测定目标蛋白的浓度。

 

02 贴壁细胞操作步骤

        1、使用冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞培养瓶或培养皿，轻轻摇动以确保细胞被彻底清洗。弃去PBS。（提示：整个过程保持培养皿在冰上进行，以防止蛋白质降解。）

        2、向培养皿中加入PBS，使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面刮离。将细胞悬液转移到微量离心管中。

        3、以1500RPM离心5分钟，弃去上清液。

        4、加入180μL冰冷的细胞裂解缓冲液，并加入20 μL新鲜的蛋白酶抑制剂混合液。（提示：如果最终提取的蛋白浓度较低，建议使用更多比例的蛋白酶抑制剂，重复此步骤。）

        5、将裂解液在冰上孵育30分钟，随后在4°C下以12,000 RPM离心10分钟，澄清裂解液。

        6、将上清液（或蛋白混合液）转移到新的管中，并存放在冰上或冷冻于-20°C或-80°C。

        7、使用分光光度计测量蛋白浓度，以确保后续分析所需的蛋白质量。

 

03 样品准备

        1、使用浓度与质量的关系公式，计算所需的蛋白提取液量，以确保每个孔中有50 μg的蛋白。

        2、向样品中加入5 μL样品缓冲液，并使用去离子水（dd H₂O）调整体积，使每个孔的体积一致。混匀。（提示：每个孔的总液量建议为15 μL）。

        3、将样品放置在干热板上加热5分钟，温度为100ºC。

 

04 凝胶制备

        10% 堆积胶

        dd H2O 3 mL

        1 M Tris–HCl 2.1 mL (pH 8.9)

        30% Acr Bis 2.8 mL

        10% SDS 80 µL

        10% APS 56 µL

        TEMED 6 µL

        6% 分离胶

        dd H₂O 2 mL

        1 M Tris–HCl 400 µL (pH 6.7)

        30% Acr Bis 600 µL

        10% SDS 36 µL

        10% APS 24 µL

        TEMED 4 µL

        注：APS：过硫酸铵；TEMED：四甲基乙烯二胺；SDS：十二烷基硫酸钠

 

        1、准备好10%的堆积胶溶液后，组装凝胶固化架（图1）。

        提示：10%的APS和TEMED使溶液固化，因此可以同时准备两种胶，如果上述试剂直到最后才添加，效果会更好。

        2、小心地将堆积胶溶液加入，直到其液面达到玻璃板上的绿色标线（图2），然后加入水。等待15至30分钟，直到胶凝固。

        提示：使用吸管可以使添加凝胶到玻璃板的过程更加简便。

        3、在移除水后，将堆积胶与分离胶叠加。

        提示：最好将设备倾斜，并使用纸巾去除水分。

        4、插入梳子，确保没有气泡。

        5、等待胶完全固化。

        提示：可以通过将一些凝胶溶液留在管中检查固化是否完成。

图1. 支撑凝胶在固化过程中保持稳定的装置。

图2. 使用移液管添加凝胶溶液。

 

05 电泳

        1、将运行缓冲液倒入电泳槽中（图3）。

        2、将凝胶放入电泳槽中，并连接到电源。

        提示：连接电源时，确保红色连接到红色，黑色连接到黑色。

        3、确保缓冲液完全覆盖凝胶，然后小心地移除梳子。

        加载分子标记（6 µL）和样品（15 µL）到每个孔中（图4）。

        4、以低电压（60 V）运行堆积胶；使用较高电压（140 V）运行分离胶（图5a和5b）。

        5、运行约1小时，或直到染料前沿跑到凝胶底部（图6）。

图3. 向电泳槽中加入运行缓冲液。

图4. 移除梳子后，向凝胶中添加样品和分子标记物。

图5. (a) 样品通过堆积胶（低电压）运行；
(b) 样品通过分离胶（高电压）运行。

图6：将凝胶运行至电泳槽底部。

 

06 电转移

        1、切割6张滤纸，使其大小适应凝胶的尺寸，并准备一张与凝胶尺寸相同的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。

        2、将海绵和滤纸浸泡在转移缓冲液中，并将PVDF膜浸泡在甲醇中。

        3、分开玻璃板，取出凝胶。

        4、按以下顺序组装转移三明治：

海绵

3张滤纸

凝胶

PVDF膜

3张滤纸

        提示：确保凝胶和PVDF膜之间没有气泡，并挤出多余的液体。

        5、将三明治移至转移装置中，设备应放在冰上以保持4ºC。向设备中添加转移缓冲液，确保三明治完全被缓冲液覆盖。将电极放在三明治上方，确保PVDF膜位于凝胶和正极之间（图7）。

        6、转移约90分钟（图8）。

        提示：转移时间应与凝胶的厚度成正比，因此对于0.75 mm厚的凝胶，转移时间可缩短为45分钟。

图7：转移应在冰上进行。

图8：转移后的膜。

 

07 封闭与抗体孵育

        1、使用5%的脱脂奶粉溶液在TBST中封闭膜，封闭时间为1小时。

        2、将一抗（主抗体）加入5%的牛血清白蛋白（BSA）中，在4°C摇床上孵育过夜（图9）。

        3、使用TBST洗膜5分钟，重复洗涤3次。

        提示：所有洗涤和抗体孵育步骤应在室温下使用摇床进行，以确保均匀震荡。

        4、将二抗（次抗体）加入5%的脱脂奶粉溶液中，继续孵育1小时。

        5、使用TBST洗膜5分钟，重复洗涤3次。

        6、准备ECL混合液（按照生产商提供的A液和B液比例）。将膜浸泡在ECL溶液中1-2分钟（图10）。

        提示：使用1000 µL移液管，确保ECL溶液完全覆盖膜的上下表面。

        7、在黑暗室中进行结果显影（图11）。

        提示：如果背景太强，减少曝光时间。

        配方（TBST缓冲液）

        1、将以下试剂溶解在800 mL蒸馏水中：

8.8 g NaCl

0.2 g KCl

3 g Tris 

        2、加入500 µL Tween-20

        3、调整pH至7.4

        4、用蒸馏水稀释至1 L

        5、通过过滤或高压蒸汽灭菌进行灭菌

图9：使用摇床孵育膜与抗体。

图10：使用1000 μL移液管将ECL混合液孵育在膜上，以帮助反应过程。

图11：使用盒子在暗室中显影膜。

 

08 常见问题及解决办法

        尽管Western Blot的操作程序相对简单，但在实验中仍可能出现许多问题，导致结果异常。问题可以分为五类：

1.异常或意外的条带

        异常条带可能是由于蛋白酶降解引起的，导致出现意外位置的条带。此时建议使用新鲜样品，并保持其冷藏，或者更换抗体。如果蛋白质出现在过高的位置，可以尝试重新加热样品，以帮助破坏四级结构。同样，模糊条带通常是由高电压或转移过程中气泡引起的。此时应确保凝胶在较低电压下运行，并正确准备转移三明治。

        更换运行缓冲液也能帮助解决此问题。非平坦条带可能是由于凝胶内的低电阻导致样品迁移过快。为解决这一问题，应优化凝胶以适应样品。最后，膜上的白色（负）条带是由于蛋白或抗体过量。

2.没有条带

        没有条带的原因可能有很多，涉及抗体、抗原或使用的缓冲液。如果使用了不合适的抗体（无论是主抗体还是二抗），条带将不会显现。

        抗体的浓度也很重要；如果抗体浓度太低，信号可能无法显示。需要注意的是，有些抗体不适用于Western Blot。没有条带的另一个原因可能是抗原浓度过低或缺失。此时，可以使用来自其他来源的抗原来确认问题是否出在样品或其他因素，如抗体。

        过长时间的洗涤也可能降低信号。缓冲液也可能导致问题。应确保转移缓冲液、TBST、运行缓冲液和ECL都是新鲜且未污染的。如果缓冲液中污染了叠氮化钠，它可能会抑制HRP的活性。

3.信号弱

        信号弱可能是由于抗体或抗原的浓度过低引起的。增加曝光时间也有助于增强条带的显现。

        另一个可能的原因是脱脂奶粉掩盖了抗原。在这种情况下，可以使用BSA或减少奶粉的使用量。

4.背景过高

        背景过高通常是由于抗体浓度过高，导致抗体与PVDF膜结合。另一个可能的问题是缓冲液过期。增加洗涤时间有助于减少背景。

        过长时间的曝光也可能导致背景过高。因此，建议检查不同的曝光时间，以确定最佳曝光时间。

5.条带上的斑驳或不均匀

        条带上的斑驳或不均匀通常是由于转移不当引起的。如果凝胶和膜之间有气泡，它会在胶片上显得较暗。使用摇床进行孵育可以避免孵育过程中出现不均匀的震荡。洗涤同样是非常重要的，它能帮助清洗背景。

        这个问题也可能是由抗体与封闭剂结合引起的；在这种情况下，可以尝试更换封闭剂。过滤封闭剂也有助于去除一些杂质。最后，这个问题可能是由于二抗的聚集引起的；在这种情况下，应对二抗进行离心和过滤，以去除聚集体。

 

        参考文献：Mahmood T, Yang P. Western blot: Technique,theory, and trouble shooting. North Am J Med Sci 2012;4:429-34.