01 细胞实验给药剂量的确定

 

        不同的产品，不同的给药方式和给药剂量，即使是同一产品，换了细胞类型或者动物模型，剂量往往也不一样。
        拿到产品后，要结合产品的名字和自己的实验设计，有目的地去查文献。

■ 细胞实验，剂量如何查？

        细胞实验通常是把小分子药物加入培养基，与细胞一起孵育，让药物发挥作用。
给药剂量的查询方法如下：输入产品名字、细胞系名称、剂量单位进行检索——

        小分子抑制剂的剂量单位多为 µM；

        重组蛋白类的剂量单位多在 ng/mL 范围。

        查到相关文献后，参考其中的使用浓度和作用时间，再结合自己的实验目的，去设计实验方案。

        Tips：如果自己的细胞系查不到对应文献，可以参考其他细胞系的剂量，先做一个“剂量–效应”曲线的梯度预实验，确定合适的使用浓度，再进入后续功能研究。

图 1.  细胞实验文献查阅

 

■ 当小分子抑制剂遇上转染

        并不是所有的剂量组都只用小分子化合物。

        有的实验人员会纠结：“我还要给细胞做转染，这个时候药该怎么加？”
        或者，“除了小分子抑制剂，我还想加自己合成的药物，顺序要怎么安排？”

        举个文献里的例子：

        某研究团队探讨κ 阿片受体（KOR）在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的作用及潜在机制。研究者先用 siRNA 敲低 KOR 表达，结果发现 KOR 下调会增强 ESCC 细胞的增殖、转移和侵袭能力。

        进一步分析发现，PI3K–Akt 通路的激活对经 siRNA 敲低 KOR 的肿瘤细胞增殖有促进作用。为了验证 AKT 激活是否是上述现象的原因，他们在转染之后加入AKT 激酶抑制剂 HY-10249A（0.5 μM）处理细胞，结果证实该抑制剂可以逆转 KOR 下调带来的增殖、侵袭和迁移增强效应。

        文献中的 “following KOR knockdown” 表明，小分子抑制剂的加入是在转染之后进行的。这种顺序安排，有助于在转染基础上观察特定通路抑制的作用。

图 2.  细胞实验文献查阅

图 3. AKT 激酶抑制可以逆转 KOR 的抑制对细胞增殖、侵袭和迁移的影响

 

        注意：这里是案例，实际给药还需多多参考文献！关注关注文献中的 Method 部分，搜索关键字以及做好整理。搜关键字以及做好整理。常见关键字 Pretreatment，co-treatment, following, before treatment 等等。

 

02 动物实验给药剂量的确定

 

■ 动物实验，给药方式怎么定？

        动物实验的给药方式有很多，比如口服、灌胃、注射（皮下注射、皮内注射、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等）。
具体方式可以参考我们的往期推文：

《小鼠实验给药方式全揭秘：如何选择最佳给药途径？》

《动物实验干货｜大小鼠常用的给药方式及剂量》

        在正式给药之前，先明确两件事：

• 你的实验动物是什么品系？
• 你的实验模型是什么类型？

        然后，用这些信息做关键词检索，查文献选择合适的给药方式，并据此设计实验方案。

        检索方法：
        在文献数据库搜索框中输入：产品名称 + 动物模型 + 剂量单位

        小分子类产品常用单位为mg/kg。

        找到相关文献后，可以参考其中的剂量范围，再根据自己的实验需要设置梯度进行预实验。

        举例：

        以LY294002为例，假设你用的是BALB/c 小鼠，做的是乳腺癌相关研究，可以这样设定关键词：

LY294002 breast tumor BALB/c mg/kg或 LY294002 breast cancer BALB/c mg/kg

        查到足够多的文献后，就可以进入阅读—分析—设计模式！

图 4. 动物实验文献查阅

 

        还有这样一种情况，可能你查到的文献都是小鼠，但实际你要做的是大鼠，但是找不到文献支持，下面策略可以考虑:

• 汇总好查阅的关于小鼠的给药剂量的文献。
• 使用常见物种给药剂量的相互换算，如下表 1 所示，根据公式 Animal rat (mg/kg) = Animal mouse (mg/kg) multiplied by (Animal mouse Km/Animal rat Km)。即大鼠体内的给药剂量为小鼠给药剂量的一半（请注意，严谨起见，设置浓度梯度剂量组）

图 5. 给药剂量的相关换算

 

03 细胞实验药物的溶解

 

        实验方案确定好了之后，下一步就是药物溶解了。药物溶解之细胞实验

■ 友好溶剂：水

        水溶性的产品，细胞实验时可以用纯 ddH2O 配置 20-100 倍的储液，使用时培养基稀释到工作液浓度后 0.22 µm 滤膜过滤。

■ 溶解界老大哥：万能溶剂 DMSO

        很多产品并不溶于水，这时候，我们的万能溶剂 DMSO 就闪亮登场了。

        细胞实验可以根据您的最大使用浓度，配置 1000X 的储液，使用时培养基稀释到工作液浓度。

        Tips: 有时候可能会遇到产品本身溶解度不高的情况，无法配置1000X 的储备液；要做好溶剂对照，排除下 DMSO 对实验结果的影响。

        但溶剂的选择，也不能想当然是 DMSO，切记切记多看说明书。

        注：有些产品很有可能是万能溶剂也溶解不了，以番茄红素为例，它的溶剂是 THF 四氢呋喃。此外，其他有机溶剂 DMF (铂类物质的好朋友)，丙酮等，虽相对 DMSO 使用较少，但它们还是药物溶解的好溶剂！

 

04 动物实验药物的溶解

 

■ 友好溶剂：水或者生理盐水

        您如果选择 PBS 或生理盐水配置，溶解度参考水中的溶解信息，配置好后 0.22 µm滤膜过滤，直接使用不可储存。因 PBS 或生理盐水的成分相对复杂，长期储存不确定是否会影响产品活性，所以不建议用 PBS 或生理盐水配置储备液。

        动物实验时，您可以根据水中的溶解度信息，选择用双蒸水配置 10 倍的储液，使用时 PBS 或生理盐水稀释 10 倍；如果溶解度受限，无法配置 10X 的水中溶解度，需用 PBS 或生理盐水现配现用。■ 对于有机溶剂溶解的产品（如 DMSO）正常小鼠可用 DMSO 配置至少 10 倍的储液，使用时加助溶剂稀释 10 倍，做好溶剂对照就可以了。

■ 免疫缺陷鼠，如裸鼠，NGS 小鼠等体弱小鼠，一般建议配置至少 50X 的储液。

        可能有小伙伴要问：50X，这是什么意思？此处以Rapamycin 为例，一般小鼠体内的给药剂量在 1-10 mg/kg。假设给药 8 mg/kg，小鼠体重为 20 g，腹腔注射，200 µL 的给药体积。

 

        我们最终的工作液浓度是 0.8 mg/mL，50X，就是配置 40 mg/mL 的储液 (此产品在 DMSO 中的溶解度为 125 mg/mL，可以满足），使用时按照 2%DMSO+40% PEG300+5% Tween 80+53% saline 稀释给药。

        动物实验中，有些模型给药剂量较大，可能无法配置10X 或者50X 储备液，那么需要考虑现配现用的方案，比如 0.5% CMC-Na/saline ，50% PEG 300 +50% saline 等方案可选。

        但无论哪种实验方案，建议使用前先取少量尝试，能达到澄清溶液或均匀的混悬液，腹腔和口服给药都是可以的。生物实验是一个不断摸索和尝试的过程，给药剂量，给药方式，溶解方案等都是要在文献的基础上摸索，这样才能达到事半功倍的效果。

       

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