01 JC-1染色工作液的配制

 

  a. 每孔用量：

六孔板每孔所需的JC-1染色工作液为1ml。

对于其他培养器皿，工作液的用量按照孔数和体积按比例增加或减少。

对于细胞悬液，每50-100万细胞需要0.5ml JC-1染色工作液。

 

b. 配制步骤：

取适量JC-1(200X浓缩液)。

按照以下比例稀释：每50µl JC-1(200X)加入8ml超纯水。

使用剧烈震荡（Vortex），确保JC-1充分溶解并混匀。

加入2ml JC-1染色缓冲液(5X)，再次混匀。

 

c.最终获得的溶液：

混合均匀后得到的溶液即为JC-1染色工作液，可用于后续的染色实验。

 

02 阳性对照的设置

 

将试剂盒中提供的CCCP(10mM)按1:1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10µM，处理细胞20分钟。随后，按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10µM CCCP处理20分钟后，线粒体膜电位会完全丧失，JC-1染色后应呈现绿色荧光；而正常细胞经过JC-1染色后应显示红色荧光。对于某些特定细胞，CCCP的作用浓度和处理时间可能有所不同，需要参考相关文献来确定最适宜的实验条件。

 

03 对于悬浮细胞

 

a.  取10-60万细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
b.  加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。将细胞悬液在 37℃的细胞培养箱中孵育20分钟。
c.  在孵育期间，按照每 1ml JC-1染色缓冲液(5X) 加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴中。
d.  37℃孵育结束后，以600g 离心4℃3-4分钟，沉淀细胞。弃上清时，注意尽量避免吸走细胞。
e.  用 JC-1染色缓冲液(1X) 洗涤细胞 2次：

第一次：加入1ml JC-1染色缓冲液(1X) 重悬细胞，600g 离心 4℃ 3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。

第二次：再加入1ml JC-1染色缓冲液(1X) 重悬细胞，600g 离心 4℃ 3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。

f. 最后，用适量的JC-1染色缓冲液(1X) 重悬细胞后，使用荧光显微镜 或 激光共聚焦显微镜 观察，也可使用 荧光分光光度计 检测或 流式细胞仪 进行分析。

 

04 对于贴壁细胞

 

注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

a.对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

b.加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

c.在孵育期间，按照每1mlJC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。

d.37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。

e.加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

f.荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

 

05 对于纯化的线粒体

 

a.把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色缓冲液(1X)稀释5倍。

b.0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10-100µg纯化的线粒体。

c.用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(time scan)，激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475-520nm范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。

d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

 

05 荧光观测和结果分析

 

检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。

出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

图1. JC-1试剂盒检测NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)线粒体膜电位的效果图。正常的NRK-52E细胞线粒体中JC-1以聚合物形式存在，呈明亮的红色荧光，细胞中的绿色荧光非常弱；使用CCCP处理使线粒体膜电位下降后，JC-1便不能以聚合物形式存在线粒体基质中，此时线粒体内红色荧光强度显著降低，而细胞浆中的绿色荧光显著增强。

 

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