一、概述

软骨细胞是关节软骨的重要组成部分，它们负责维持软骨的结构和功能。由于关节软骨损伤后难以自我修复，组织工程技术通过使用软骨细胞或间充质干细胞（MSCs）作为种子细胞，结合生物材料支架，来促进软骨的再生。目前，可注射水凝胶因其微创性和生物相容性，被广泛研究用于软骨修复。这些材料可以作为细胞载体，促进软骨细胞的移植和软骨基质的再生。

二、实验材料

Hank’s溶液、PBS缓冲液、II型胶原酶、DMEM培养基、青链霉素

三、实验方法

1、动物取材：取成年新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气处死后，取下兔子的双腿，立即用75%乙醇浸泡。

2、组织处理：移入细胞房内，去除双腿表面的皮毛及肌肉，剪取关节段，移至超菌工作台内。PBS洗涤数次，用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。

3、胰酶消化：软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，将软骨组织剪成1mm³左右的大小。移到离心管中加3倍体积的25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min。

4、胶原酶消化：4℃静置5min；弃上清，PBS洗涤，去上清。加入2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化2h。

5、收集细胞：加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

6、细胞培养：细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全展开后即可固定做原代鉴定。

7、细胞鉴定：软骨细胞可特异性合成葡萄糖糖胺聚糖（GAG）、II型和X型胶原，具有碱性磷酸酶活性，细胞外基质经过甲苯胺蓝染色呈现异染性。

注意事项：软骨细胞体外培养前三代一般会保持软骨生物学特性，之后可能会分化为梭形，尽量实验在前三代内完成。