一、概述

巨噬细胞为当前研究的热点之一，在免疫调节中发挥重要作用，可以调节炎症反应以及促进组织修复。另外巨噬细胞可以通过基因改造，如CAR-M（嵌合抗原受体巨噬细胞），增强抗肿瘤性能。此外，在自身免疫性疾病，感染性疾病，药物传送系统等方向，巨噬细胞也是当前研究热点。

二、实验中巨噬细胞来源

1、组织驻留巨噬细胞（Tissue-Resident Macrophages, TRMs）：这些巨噬细胞是独立于造血系统的，它们可以在局部区域内自我更新维持。它们在胚胎发育过程中从卵黄囊中提取，并在不同的组织中驻留，具有自我更新的能力。例如，小胶质细胞（microglia cell）是中枢神经系统中的巨噬细胞，肺泡巨噬细胞（尘细胞）负责吞噬进入肺泡的尘埃粒子，枯否细胞（Kupffer Cells）则是肝脏中的巨噬细胞，它们在各自的组织中发挥着免疫防御和组织修复的功能。

2、单核细胞来源的巨噬细胞（Monocyte-Derived Macrophages, MDMs）：这些巨噬细胞来源于血液中的单核细胞，它们穿越血管内皮迁徙到不同组织，并分化成具有组织特异性的巨噬细胞。获取途径主要是外周血和骨髓来源的单核细胞，在炎症或组织损伤时，单核细胞可以迅速迁移到受损组织并分化成巨噬细胞，参与炎症反应和组织修复。

3、细胞系分化而来 某些细胞系如THP-1，RAW264.7等可以被诱导分化成巨噬细胞样的细胞。这些细胞系提供了一种快速获得巨噬细胞的方法，虽然它们的表型可能与原代巨噬细胞有所不同。

三、巨噬细胞诱导

根据其来源不同，诱导分化为巨噬细胞的方法也不尽相同。且巨噬细胞按照其类型大致可以分为M1型与M2型。

1、THP-1 细胞，RAW264.7细胞可以通过佛波酯（PMA）诱导分化为巨噬细胞，并通过添加特定的细胞因子如IFN-γ和LPS诱导M1型极化，或通过添加IL-4和IL-13诱导M2型极化。U937 是另一种单核细胞白血病细胞系，也可以被诱导分化为巨噬细胞。与THP-1细胞相比，U937 细胞对M2型巨噬细胞极化条件更敏感。

2、对于外周血来源的以及骨髓来源的单核细胞，可在含有M-CSF的培养基中培养，以诱导它们分化成巨噬细胞，后续可根据需求再诱导为M1或M2亚型。

四、组织巨噬细胞获取

1、脾脏巨噬细胞获取 脾脏是重要的免疫器官，含有大量的巨噬细胞。通过物理方法将脾脏研磨后，使用密度梯度离心法分离出巨噬细胞。这种方法可以获得数量较多的巨噬细胞。

（1）动物的准备和脾脏的取出：首先，选择适当的实验动物，如小鼠，进行麻醉并无菌条件下取出脾脏。

（2）脾脏细胞的分离：将取出的脾脏置于含有适当培养液的容器中，通常使用含有胎牛血清的RPMI-1640培养基。使用无菌的剪刀和镊子将脾脏组织剪碎，将脾脏机械研磨，加入RPMI-1640培养基混匀，并过200目细胞筛。

（3）细胞悬液的制备：1 500 r/min，5min，离心收集细胞加入红细胞裂解液以除去红细胞，再次离心后加入培养基重悬细胞。

（4）细胞培养：将细胞悬液转移到培养容器中，如培养皿或培养瓶，并在含有5% CO2的恒温培养箱中培养。巨噬细胞会附着在培养容器的壁上，而非巨噬细胞则不会。

（5）纯化：培养一定时间后（通常2-3h或更长），更换培养基以去除未附着的细胞。附着的细胞主要是巨噬细胞，可以通过更换培养基进一步纯化。

（6）细胞的鉴定：通过形态学观察、吞噬功能测试、细胞表面标记物的流式细胞分析等方法对培养的巨噬细胞进行鉴定。

2、肺泡灌洗巨噬细胞获取

（1）肺泡灌洗：对小鼠或者大鼠进行适当的麻醉，通过气管插入无菌的导管，向肺内灌入无菌的生理盐水（通常是冷的 PBS 或 Hank's 缓冲液）。灌洗液的量根据动物的大小而定，小鼠可能需要1-5 mL，而大鼠可能需要10-20 mL。

（2）收集细胞：轻轻按摩动物的胸部，以帮助生理盐水在肺泡中分布均匀，然后缓慢抽回灌洗液。重复此过程几次，以确保收集到尽可能多的肺泡巨噬细胞。

（3）细胞离心：将收集到的肺泡灌洗液进行1 500 r/min，5min离心，然后重悬细胞于适当的培养基中。

（4）细胞计数和纯化：使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数，在培养箱内内培养约2h，去除未贴壁的悬浮细胞。

（5）细胞鉴定：通过显微镜观察细胞形态，以及使用特定的巨噬细胞标记物（如CD68或CD11c）进行流式细胞分析，来鉴定收集到的细胞是否为肺泡巨噬细胞。

（6）细胞培养：将纯化的肺泡巨噬细胞接种到培养容器中，并在含有5% CO2的恒温培养箱中培养。

（7）细胞活性检测：通过吞噬实验和酶活性检测（如酸性磷酸酶染色）来评估肺泡巨噬细胞的活性。

3、腹腔巨噬细胞获取

收集炎性腹腔巨噬细胞时，处死小鼠前先用注射器向小鼠腹腔注射 1 mL 3% 豚蛋白胨肉汤或 2 mL 无菌的液体石蜡，待 3~4 天后进行下述处理。

（1）小鼠颈椎离断处死，75％ 乙醇消毒，移入超净台内仰卧固定于解剖固定板上。

（2）剪开腹部毛皮层，暴露大面积腹膜，避开血管，注射器抽取 5 mL 含双抗的 RPMI 1640 培养基，腹腔注入，轻揉腹部 1~2 min，静置5min。

（3）用镊子提起腹膜剪一小口（吸头可进入即可），用移液器吸取腹腔内液体（注意避开肠管），置于离心管中。

（4）离心洗涤 1 500 r/min，5min，再用含双抗的 RPMI 1640 培养基洗涤一次后离心，加入新鲜培养液重新悬浮细胞，计数。

（5）调整细胞至所需浓度，置于平皿或细胞培养孔板中，37 ℃ CO2 孵箱中孵育 1～2h。

（6）去除培养液，以 37 ℃ 预温培养液洗涤 2 遍，弃去未黏附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞，再加入适当培养液培养。