一、概述

神经细胞在研究与脑相关的疾病中具有重要的作用，也是研究的热点方向之一，在治疗神经系统疾病方面展现出巨大的潜力和应用前景。另外，在细胞治疗，神经发育等方面具有重要的意义。以下以大鼠脑皮质神经元为例介绍原代培养方法。

二、实验材料

手术器械，培养容器、0.125%胰蛋白酶、DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、B27、L-谷氨酰胺、多聚赖氨酸、PBS、D-Hank's等。

三、实验方法

1、选择合适的动物：如胎鼠或新生24h的大鼠。

2、取出大脑：动物处死以后，在无菌条件下，快速取出动物的大脑，放入预冷的D-Hank's液或PBS中。

3、组织块的剪切：去除大脑上的多余组织，如脑膜、血管等。将大脑皮层剪切成1-2mm大小的组织块。整个过程需要在冰上操作。

4、细胞悬液的制备：使用0.125%胰蛋白酶处理组织块，在37°C下孵育约20min，间隔5min检查细胞分离情况，避免过度消化。当组织块被充分分散后，加入含有血清的培养基终止消化过程。并且1000rpm离心5min，除掉上清液，加入新鲜的DMEM/F12培养基，使用200目的细胞筛网过滤细胞悬液，去除未分散的组织碎片。

5、细胞计数：使用血细胞计数板进行细胞计数。

6、细胞接种：根据所需的细胞密度，将细胞悬液接种到预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶或培养板中。

7、培养基更换：在细胞接种后的6h更换Neurobasal培养基（含2%B-27；1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺；1%青链霉素），在后续的培养过程中需半量换液。

8、细胞鉴定：使用免疫荧光染色等方法对神经细胞进行鉴定，常用的标记物包括Nestin、MAP2（微管相关蛋白2）等。

9、记录和分析：在整个过程中，详细记录每一步的条件和结果，以便于后续分析和优化。