概述

        血液中含有红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等多种细胞，这些细胞在机体中不断死亡和更新。更新的细胞均来源于多能造血干细胞(hematopietic stem cells,HSC)。造血干细胞在适当的条件下可以自我更新，并增殖、分化成为各种具有一定功能的成熟血细胞。利用其高度的增殖能力和多向分化潜能，通过细胞工程技术，对分离纯化的造血干细胞进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等，从而能够在较短的时间内得到大量的目的血细胞。造血干细胞可能在干细胞移植、生物免疫治疗、输血、细胞治疗和基因治疗等领域中广泛应用。

用品

        (1)培养液：RPMI 1640，含20% FBS。

        (2)Percoll液：按说明书配制成1.10 g/mL、1.080 g/ml、1.055 g/ml 3 种密度。1.080g/mL密度分离液中加入0.12μg/mL麦芽凝集素WGA/FITC。

        (3)乳糜木瓜蛋白酶(chmopapain)母液：浓度为2000U/mL，用前稀释。

        (4)RPMI/HAS：含1%人血清白蛋白(HSA)的RPMI 1640。

        (5)RPMI/HAS/IG：含0.5%人丙种球蛋白(1C)的RPMI/HAS

        (6)手术刀、弯钳、眼科剪、1mL注射器、手术弯盘、青霉素小瓶、细胞计数板。

步骤

        为了获得高纯度的造血干细胞，以下方法可以组合进行。

        (1)密度梯度离心法

        ①脱颈处死小鼠，取股骨，去除附着组织，剪掉股骨大转子。

        ② 用无菌针头在膝关节上刺一个孔用带7号针头的1m注射器吸培养液将骨髓冲出，重复操作，直至股骨变白。或在临床上抽取志愿者髂后上嵴骨髓液。

        ③用带4号半针头的注射器过滤将骨髓制成单细胞悬液，移入另一无菌小瓶中。

        ④将Percoll 液按密度从大到小依次移人离心管，将细胞悬液轻轻注入离心管底部，以1500~2000r/min 离心 15 min,收集上层和中层分离液之间的细胞。

        ⑤培养液洗2遍，细胞计数。

        ⑥常规细胞制备后立即使用，也可以在含20%血清的培养液中4℃或室温保存5 ~6 h。

        (2)流式细胞仪分选法(FACS sorting)

        ①取骨髓细胞步骤同密度梯度离心法步骤①~②，在Percoll 液分离过程中,一部分细胞被标记上WGA/FIAC，用培养液洗2遍。

        ②上流式细胞仪进行细胞分选。

        ③将收集到的细胞用 N-乙酰基葡萄糖胺将细胞表面的WGA/FITC洗脱，用培养液洗2遍，细胞计数。

        (3)平衡黏附法(panning)

        ①取骨髓细胞步骤同密度梯度离心法步骤①~④。

        ②用CD33单抗包被一次性塑料平皿(直径60 mm，Nunc 公司)，4℃过夜。

        ③弃上清，培养液洗2遍，加入5mL0.2%BSA-培养液，室温静置30 min。

        ④弃上清，培养液洗2遍，加入细胞(2~3)x10⁷/皿，4℃孵育1h，期间轻晃平皿3~4次。

        ⑤收集未贴壁的细胞(主要是造血干细胞)，培养液洗2遍，收集细胞。

        (4)免疫磁珠分离法(immunomagnetic beads)

        ①取骨髓细胞步骤同密度梯度离心法步骤①~②

        ②预备磁珠：将羊抗小鼠IgG-beads根据收集的细胞量，按使用说明书取适量，RPMVHAS洗2遍，重悬于RPMI/HAS中(根据磁架大小，选择加入RPMIHAS液的体积)。

        ③细胞致敏：按说明书以一定量的CD34单克隆抗体与细胞在4℃于旋转混合器上低速转动孵育20~40min。

        ④RPMI/HAS液洗3遍，除去未结合抗体的细胞，致敏细胞以2x10⁷/mL细胞密度重悬于RPMI/HAS/IG液中

        ⑤按磁珠与细胞1：2比例混合磁珠和致敏细胞，4℃于旋转混合器上低速转动孵育 30~40 min。

        ⑥上磁架收集CD34+细胞，重悬于新配制的chmopapain工作液中(1 mL RP-M//HAS中加入0.125mL chmopapain),在室温于旋转混合器上低速转动孵育15 min,再加入20mL预冷的 RPMI/HAS上磁架，洗脱磁珠，收集稀释液。

        ⑦4℃ 400 r/min 离心5 min，收集细胞，RPMI/HAS 重悬细胞备用。

操作提示

        造血干细胞是包含多种类型细胞的混合细胞群，在培养过程中由于没有明显的形态特征，因此，只能通过细胞表面标志和功能进行鉴定。常用荧光标记的单抗通过流式细胞仪进行鉴定。

结果及鉴定

        (1)细胞形态：由于造血干细胞是一种未分化细胞，在造血组织中存在率极低，很难从形态上判断某一细胞是否是造血干细胞。目前，人们认为，造血干细胞为单核细胞，直径约7~10μm，形似淋巴细胞，核浆比例大，核呈圆形，染色质较小，分布分散，胞质内有少量线粒体和较多游离核糖体，无高尔基体、溶酶体和内质网。

        (2)脾结节形成单位(CFU-S)测定法：给受致死量照射、丧失骨髓和脾脏造血功能的小鼠移植同种造血干细胞，在第8天和第14天数脾脏表面形成的结节，此法只适用于啮齿类动物，是检测小鼠造血干细胞的经典方法。

        (3)造血干细胞自我更新实验和骨髓再移植测试：给受致死量照射、丧失骨髓和脾脏造血功能的小鼠或 SCID 小鼠输入造血干细胞，观察植入的造血干细胞是否具有长期多系造血细胞更新能力或重建髓系造血能力的情况。但SCID小鼠寿命较短，难以长期观察，加之胸腺缺乏，无法观察淋巴系造血重建。

        (4)子宫内移植模型：绵羊子宫内移植是人造血干细胞检测中最可靠的模型。在胎羊免疫系统发育前将人造血干细胞植人胚胎，绵羊出生后，长期观察其体内的人造血干细胞是否具有多系造血细胞更新能力。

        (5)竞争性再移植实验：将两种带有不同遗传学标志的造血干细胞同时移植入受致死量照射、丧失骨髓和脾脏造血功能的小鼠，长期观察各种造血干细胞在体内是否具有多系造血细胞更新能力。

        (6)体外克隆实验：将造血干细胞以5x10⁵/mL细胞密度接种于受致死剂量射线照射的骨髓基质细胞(预先以5x10⁵/mL细胞密度接种于6孔板内)层上，培养14~28d，观察卵石样造血区域(cobblestone area)形成情况。或在造血干细胞加入后2h，洗去未与骨髓基质细胞结合的细胞，再加人1mL 0.3%琼脂，培养28 d，观察造血干细胞在半固体培养条件下形成克隆的情况，具体实验方法见软琼脂克隆实验。

        (7)表面特征标志的检测：通常认为造血干细胞的表面标志特征为CD34+、CD38-、LN-、HLA-DR-、Thy1+、c-Kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-，其中最重要的标志为CD34+，目前常用来进行造血干细胞的特异筛选。