概述

        诱导性多能干细胞(inducible.pluripo-tentstemcells，iPS)是指通过载体将经过筛选的特定的转录因子或小分子化合物转入体细胞，对体细胞进行重编程使体细胞转变为具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞。由于iPS细胞的潜能类似于胚胎干细胞，所以可以作为再生医学的组织来源，将来有望用于治疗糖尿病、脊髓损伤、心血管疾病、神经退行性病变等疾病。潜在的益处是可以避免机体发生免疫排斥反应，不受伦理道德和组织材料来源的限制。iPS细胞的研究是一项具有开创性治疗性克隆的基础研究，为干细胞医学应用开辟了一条新的途径，被认为是干细胞领域乃至整个生物学领域的重大发现。2006年，Takahashi和Yamanaka首次通过反转录病毒转基因的方法将4个经过筛选的基因(0ct4、Sox2、c-Myc、KI4)导人已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，使其逆转为多能干细胞。随后，有多名学者成功诱导出iPS细胞，并通过外源基因的选择和转染条件的优化以及筛选方法的改进提高了 iPS 细胞的质量和产出。本节参照Yamanaka于2007年发表在Cell的方法，利用人的体细胞诱导产生iPS 细胞，介绍其操作程序。

用品

        (1)培养液：D-PBSA,添加青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)，真皮成纤维细胞培养基，Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(含2mmol/L谷氨酰胺,添加10%FBS)，人胚胎干细胞生长培养基。

        (2)HEK293T 细胞。

        Percoll 液：按说明书配制成1.10g/mL、1.080g/mL、1.055g/mL3种密度。1.080g/mL密度分离液中加入0.12μg/mL麦芽凝集素WGA/FITC

        (3)胰蛋白酶，胶原酶。

        (4)明胶(A型)，聚凝胺，Fugene6 试剂，无内毒素大提试剂盒。

        (5)离心管，多孔板，培养皿，滤器(0.22 μm)

        (6)超速离心机，荧光显微镜。

        (7)皮肤打孔器，手术刀，弯钳，眼科剪。

步骤

        人真皮成纤维细胞系的制备如下。

        (1)70%酒精消毒，4mm皮肤打孔器采集活检皮肤，将标本装入10mL装有培养基的15mL离心管。

        (2)将皮肤标本从离心管中取出，装人2mL胶原酶的15mL离心管内，孵育2 h。

        (3)消化皮肤样本，剥离真皮层，将真皮层转移到新的培养皿中，将真皮尽量切碎，将得到的浆状物转移到用明胶包被的24孔板，放入CO₂孵箱培养30min，使其贴壁。

        (4)取出24孔板，加人2mL DFM。放入CO₂孵箱，继续培养11~15d，当细胞接近汇合时传代，选用第2~4代细胞。

高滴度编码iPS因子的转染病毒制备如下。

        (1)HEK293T接种：HEK293T细胞在不含抗生素的DMEM(含10%胎牛血清)培养基中生长几天，胰蛋白酶消化细胞，细胞计数，按1x10⁶/10cm培养皿的密度均匀接种，37℃、5%CO₂孵箱培养，用Qiagen 无内毒素试剂盒提取质粒，每个编码重编程因子的质粒各提取几毫克。

        (2)重编程和病毒包装载体转染HEK293Tp细胞：细胞大约50%汇合时每个皿加入10mL新鲜DMEM养基(10%胎牛血清)、重编程载体和病毒包装载体转染细胞，按照厂家说明书使用Fu-gene6试剂。将转染混合物逐渐滴加到每个皿中，每个培养板转染一个重编程载体(FU-tet-o-hKlf4，FU-tet-o-hOct4,FU-tet-o-hSox2，FU-tet-o-hc -Myc)和两个病毒包装载体delta 8.9及vsv-g，总比例为4：3：2。

        (3)更换培养基：按照Fugene6说明书，每个皿用D-PBSA 清洗，加人5mL新鲜培养基。

        (4)从上清液中收集和浓缩病毒颗粒：使用无气溶胶的超速离心管，通过超速离心浓缩病毒颗粒，重悬。将用DFM重悬的1x10⁵个皮肤成纤维细胞接种到包被过的3.5cm培养皿中。

        (5)转染：前一天接种的成纤维细胞，加入2mL DFM，补充6μg/mL 聚凝胺，10μL的rtTA和5μL的重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)病毒。

        (6)饲养层的准备：在10cm组织培养皿中准备高质量的饲养层。

        (7)传代：胰蛋白酶消化转染的真皮成纤维细胞，10mLDFM重悬，传代接种到饲养层上，接种密度90000/10cm皿。

        (8)添加多西环素：细胞换液，加入2mL人胚胎干细胞培养基，并添加0.5μg/mL多西环素，诱导重编程因子的表达，每3d换液一次(含0.5μg/mL多西环素的培养基)，9d后换液时将多西环素浓度减半，继续培养，直至克隆出现(大约在转染后3周)。一旦出现克隆，立即停用多西环素。

操作提示

        (1)HEK293T细胞，需要进行支原体检测。

        (2)对于转染前细胞培养中，细胞汇合度不宜超过50%，当超过50%时细胞活力会降低，使病毒转染成功率降低。

        (3)转染过程中，4个重编程因子的理想配比是1：1：1：1。由于有些重编程因子的产出会影响其他因子的产出，因此，最好每个重编程因子分别包装病毒，然后全部结束后过滤，并将4个皿的培养基混合。

        (4)转染后培养基上清一定要过滤，以防止产生病毒的HEK293T细胞混入要进行重编程的成纤维细胞培养基。

结果及鉴定

        (1)细胞形态：显微镜下观察，iPS克隆与人胚胎干细胞类似：扁平有活力的集落，边界清晰，细胞核显著且核浆比高。

        (2)用碱性磷酸酶试剂盒进行组织非特异性的碱性磷酸酶染色。

        (3)对培养细胞的克隆进行hNanog免疫染色，以确定多能性相关的其他基因已经重编程。

        (4)功能评价：在缺少bFCF的培养基中，培养的细胞能形成类胚体，并且单层细胞能向3个胚层分化。