概述

        小鼠胚胎生殖细胞是生殖嵴的原生殖细胞，被认为具有胚胎干细胞的自我更新能力和多能分化潜力，因此，被视为胚胎性干细胞。该细胞数目较多，取材过程也相对容易，是研究哺乳动物干细胞和早期细胞分化的重要工具。

用品

        (1)培养基试剂和用品：胎牛血清、新生牛血清、非必需氨基酸、2-基乙醇、丙酮酸钠、bFGF、Percoll细胞分离液、丝裂霉素C、NBT/BCIP试剂盒、胰蛋白酶、细胞培养用品和设备、玻璃吸管，显微外科手术器械、倒置显微镜、立体显微镜、普通离心机等。

        (2)实验动物：昆明小白鼠，8~10周龄，体重30~35 g。

步骤

        (1)获取胎鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)：将雌鼠与雄鼠合笼，次日见阴栓者记为0.5d，取10~14d的胎鼠，去除胚胎头和内脏，无菌PBS漂洗2遍，用眼科剪充分剪碎，转移到50ml的离心管中，加入20~30mL细胞消化液(PBS液，含0.25%胰蛋白酶，0.04% EDTA)37℃轻轻震荡消化约30min，过200目细胞筛，PBS离心漂洗2次，重悬细胞并接种，按普通方法传代，冻存，备用。换液时收集细胞上清液，4000 r/min 离心 15 min，过滤后使用。

        (2)MEF饲养层的制备：取80%汇合的MEFs，加入10μg/mL丝裂霉素C在CO₂孵箱中孵育2h，加入细胞消化液,再用饲养层细胞培养液中和并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度到4x10⁵/mL，在六孔板中每孔加入3mL，置CO₂孵箱中待用。

        (3)获取胚胎生殖细胞：取10d的胎鼠;在立体显微镜下借助显微外科器械，于其腰骶部寻找并分离生殖嵴，再转移到细胞消化液中，用细口径吸管吹打，把生殖嵴消化成单细胞悬液，以0.5个胚胎/孔转移到饲养层细胞上，加入胚胎干细胞培养液(α-MEM，10%胎牛血清：5%小牛血清，1mmol/L丙酮酸钠,2 mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L左旋谷氨酰胺，100U/mL，bFGF)置于CO₂孵箱中。

        (4)胚胎生殖细胞的常规培养：每日更换培养液，接种10d左右，选择鸟巢状并分化明显的细胞集落，按照常规手工挑克隆的方法选择并传代，或者使用Percoll液配制成细胞分离液，常规消化后进行梯度离心，选择含原生殖细胞最多的部分再进行分离，最后接种在新的饲养层细胞上。

操作提示

        (1)饲养层的制备最重要的是饲养细胞的密度，一般MEF细胞密度在(7.5~10)x10⁴/cm²

        (2)MEF细胞在使用前必须经过支原体的检测。

        (3)培养ES 细胞过程中，ES 细胞对血清的质量要求很严格，尤其是在胚泡和胚胎培养的初期。所有血清在使用前都应检测血清质量和效率。

胚胎生殖细胞的鉴定

        (1)形态观察：胚胎生殖细胞的胞体较大，呈圆形，直径约15~18μm，胞核大，胞核内的物质折光性强，胞体可见伪足伸出;集落表现出胚胎干细胞集落的特有形态，呈鸟巢状突起在饲养层细胞上：集落内细胞边界不清，但集落和饲养层细胞的界限却清晰可辨。选择典型的集落进行追踪观察。

        (2)AKP染色：4%甲醛溶液固定后，把新配制的染色液(NBT：BCIP稀释液)按照说明书的方法加入，常温下染色5min后镜下检查，阳性细胞为蓝紫色细胞。

        (3)诱导分化：采用无血清培养液按照常规方法培养，或延长细胞换液间隔由每日换液改成每2d换液，诱导干细胞的分化，可观察到多种细胞形态。