1、形态学及生长行为鉴定

        胚胎干细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大有一个或几个核仁。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和少量线粒体，核型为正常整倍体。小鼠ES细胞直径一般为12~14 μm，牛为11~19 μm,猪为12~15 μm，免为9~12μm。各种动物的原始生殖细胞大小与ES细胞相差不大。据Leichthammer等(1990)测定小鼠PCCs(原始生殖细胞)直径为(13±1.3)μm(n=23)，牛为(18±1.6)μm(n=28)，猪为(13±1.4)μm(n=25)，兔为(10.5±1.2)μm(n=18)。ES细胞在体外分化抑制培养的过程中呈克隆状生长，有明显的聚集倾向，集落形似鸟巢细胞，界限不清，集落周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。

2、碱性磷酸酶染色

        碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)的存在是细胞保持未分化状态的一个重要指标，ES细胞中含有丰富的AKP而已分化的ES细胞AKP呈弱阳性或阴性。常用的AKP染色方法：快绿B盐5mg,HCl(36%，双蒸水稀释)0.08mL,4% NaNO₂ 0.02 mL，萘酚0.1 mL，AS -TR磷酸钠10 mg，DMSO 0.5 mL，PBS(pH8.6)5 mL，10% MgCl₂ 0.05 mL。以1mol/的NaOH调整pH至8.4，此时溶液清亮，用此工作液在37℃，5%CO₂及饱和湿度条件下作用待鉴定细胞20~30min后，用PBS冲洗3次，再以甘油PBS封片，在倒置显微镜下观察，AKP阳性细胞呈红棕色，其他细胞为淡黄色或不着色。为了进一步确保实验的可靠性，在AKP染色过程中常设立对照组，即以已建系ES细胞(或小鼠的桑甚胚或囊胚)作为阳性对照，作用液中不含萘酚为阴性对照。

        AKP染色的另一种方法为：将待测细胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定底物缓冲液(100mmol/L Tris-HCI pH9.5,50 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl₂ ,0.1%Tween-20)平衡，室温避光染色。染色液为：75mg/mL nitroblue tetrazoliumsalt(NBT)溶于70% dimethylformamide(DMF)，50 mg/mL,5-bromo -4-chloro-3 -indolyl phosphate toluidiniumsalt ( BCIP)溶于100%DMF。染色前分别取45μL NBT液和35μL BCIP液溶于10mL底物缓冲液中，新鲜配制。阳性反应细胞被染为深蓝紫色，饲养层细胞、分化细胞不着色。

2、胚胎特异性表面抗原的检测

        在胚胎的原始外胚层细胞、ES 细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均有胚胎特异性表面抗原(SSEA-1)的表达。SSEA-1检测是一种间接免疫荧光法，所用试剂为：①第一抗体SSEA-1(鼠抗F9细胞单克隆抗体)，1：100稀释;②第二抗体羊抗鼠-Rhoda mine(罗丹明荧光染料)，1：10稀释;③封闭液羊抗免IgG。检测方法可概括为：杜氏PBS洗3次，2%Triton作用20min，再以杜氏PBS 清洗3次，封闭液中作用20 min后，杜氏PBS洗3次，加第一抗体于4℃条件下过夜,杜氏PBS洗3次，加第二抗体30℃作用30min，杜氏PBS洗3次后，用甘油PBS封片，在荧光显微镜下观察，细胞出现荧光则说明有SSEA-1的存在。