在进行疾病治疗时，需要将药物通过口服、注射等不同的方法途径递送到人体内才能发挥作用。

        而在我们日常的科学实验研究中，往往需要使用慢病毒、腺相关病毒等工具注射到动物体内研究动物机体功能及代谢路径等，以观察阐明疾病发生发展机制。

        这时就需要选择一定的注射方式，今天小编给大家介绍一下动物实验中各种不同给药途径的方法步骤，供大家参考。

 

01 尾静脉注射

 

1. 首先，将小鼠尾部轻轻提起，放置于鼠笼盖或实验者手背上，给予适度安抚以缓解其紧张情绪。
2. 接着，将小鼠固定于适配的约束器内，确保盖子紧闭，并使尾部充分暴露；使用酒精棉球擦拭尾部，或借助温水、浴霸等方式对尾巴进行加热，促进血管扩张；
3. 将尾巴拉直，使其红色静脉轮廓清晰可辨；
4. 在距尾尖约三分之一处进行穿刺，若针头顺利进入，无明显阻力，表明已准确刺入静脉；
5. 观察针筒内是否有回血现象，若出现回血，即可开始注射；
6. 注射结束后，用无菌棉球按压针口约1分钟以帮助止血。
7. 最后，取出小鼠，轻柔地放回原笼内进行恢复。

补充说明：

参考文献 “AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats” 指出，对于6周龄、体重约150克的成年大鼠，在尾静脉注射AAV9（如AAV9-TDP-43或AAV9-GFP）时，推荐剂量范围为每千克体重3×10¹³～1×10¹⁴ v.g。注射液体积应严格控制在标准限度内，避免超量，例如对于体重250克的大鼠，建议注射体积为250～500μL。就150克左右的年轻成年大鼠而言，推荐使用的注射体积约为200μL。

 

02 颞/面静脉注射

 

1. 首先，将一只仔鼠（幼龄小鼠）直接置于湿冰上，使其低温麻醉，时长控制在30～60秒之间。由于过度暴露于低温环境可能诱发一系列严重并发症，如心律失常（包括心室颤动）、组织缺氧及代谢性酸中毒，因此不宜延长冰上时间。有文献指出，该时间范围足以显著减缓小鼠的活动，从而为注射提供操作窗口。如需更深层次的麻醉状态，可考虑使用1–2%异氟烷吸入麻醉剂作为替代或补充手段。

当小鼠仍处于低温麻醉状态时，迅速准备注射装置。此时，将30μL伊文思蓝（Evans Blue）染料装入注射器，并排除气泡备用。

2. 待小鼠完全进入麻醉状态（即虽仍保持自主呼吸，但在冰面上已无明显运动反应）后，将其转移至显微镜下进行操作。若操作者为右手操作，应将小鼠头部朝向左侧，使注射部位靠近操作者右手。左手辅助固定头部位置：将食指置于枪口区域，中指扶持耳塞尾端，使耳塞被夹持于两指之间，便于稳定。
3. 接下来，需识别目标血管。首先观察耳前区域的表浅毛细血管，在操纵皮肤时会随之移动。注意：毛细血管本身并非注射靶点，其存在主要用于辅助定位。注射目标为其下方的静脉血管，常表现为一条不随皮肤移动的暗色阴影，即颞静脉，其走向由背侧向腹侧延展，最终汇入颈静脉。
4. 在注射过程中，应将针头以斜面朝上方式缓慢插入颞静脉。如针尖已正确置入血管内，常可通过皮肤清晰观察到针斜面内有血液回流填充的现象。此时缓慢推进注射器柱塞，注射过程中应密切观察染料沿小鼠面部侧静脉走向漂白的痕迹，确认药液成功注入。
5. 为防止注射液回流，建议注射完成后继续将针头保留在血管内10～15秒，以稳定药液扩散并避免药剂逸出。

图A：临时注射平台；图B：手指位置；图C：注射位点。

 

03 腹腔注射

 

1. 将小鼠尾部从笼中提起，轻轻放置于手背上，给予适当安抚，以减少应激反应。
2. 使用左手固定小鼠：拇指与食指夹住其颈背部，无名指与小指稳住尾部及后肢，使其腹面朝上，头部略低。
3. 右手持注射器，从小鼠下腹部距腹白线约0.5cm处进针，针头与腹面呈约30°夹角。刺入时动作应迅速但柔和，初始阶段可感受到皮肤张力，随后阻力骤减，提示针头已进入腹腔。回抽无回血表明未刺穿内脏，可进行注射操作（注意：进针深度不应超过1cm，避免损伤内脏器官）。
4. 注射完毕后，缓慢拔出针头，并略作旋转，以减少药液外漏的可能。
5. 操作完成后，将小鼠安全放回笼中，继续饲养并观察其状态。

小鼠腹腔注射示意图

 

04 视网膜下注射

 

1. 成年小鼠（6～8周龄）采用腹腔注射方式进行麻醉。
2. 使用含有0.5%去氧肾上腺素与0.5%托吡卡胺的滴眼液进行瞳孔扩张处理。
3. 准备已装载1.5～2μL病毒液的微量注射器备用。
4. 为便于操作，先打开眼睑，使眼球赤道部分暴露，并在显微镜下进行观察。整个注射过程中需保持赤道区域裸露，以防止操作期间针头移位。可用手指轻托眼眶边缘以稳定眼球位置。
5. 在角膜表面滴加一滴眼用粘弹性材料，用于润滑和保护眼球表面。
6. 在角膜顶部放置小型圆形盖玻片，以便清晰观察视网膜区域。
7. 使用30G，1/2无菌针头在角膜缘后方预穿一个小孔，右眼建议在下方穿刺，左眼则选上方部位，方便后续操作。
8. 将33G钝头针经穿孔处缓慢插入视网膜下腔，直至感觉到轻微阻力，提示针尖到达目标层。
9. 缓慢注入病毒载体（如1×10⁶TU/μL），操作需平稳，以防视网膜震动或组织损伤，注射完毕后轻柔拔针。
10. 注射结束后，在显微镜下检查视网膜是否形成注射性水泡，同时确认无出血情况发生。
11. 操作完成后，轻合眼睑覆盖注射区域，促进恢复。
12. 最后，将小鼠放回笼中饲养，持续观察其活动情况，确保其状态稳定。

眼球组织的横断面染色切片图

 

05 脑立体定位注射

 

第一部分：术前准备

        实验所需器材包括：脑立体定位仪、常规外科手术工具、颅骨钻、微量注射器、干棉球、1%戊巴比妥钠、生理盐水、1mL注射器及实验用小鼠。

        首先，使用1%戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉，推荐剂量为80mg/100 g体重。注射后取出小鼠，静置约5～10分钟以待麻醉起效。确认麻醉充分后，使用剃毛器清除其头部毛发。

第二部分：小鼠固定与开颅

        将麻醉并剃毛处理后的小鼠固定于脑立体定位仪中。

        固定操作如下：先将门齿卡入齿夹，轻轻下压横杆以稳固头部。调整适配器的高度与前后位置，使左右耳杆能够顺利插入小鼠外耳道。左手轻托头部，将左侧耳杆插入耳道后，再对准U型开口中心，依次锁紧两侧耳杆与门齿夹螺丝，确保头部稳固不晃动。

        固定确认标准为：鼻尖对准中线、头部平衡稳定、提起尾部不脱落，同时目测大脑位于水平状态。随后使用剃刀或脱毛膏处理手术区域，再用手术刀纵切头皮，剥离覆盖颅骨表面的结缔组织，充分暴露前囟与后囟。

        参照小鼠脑图谱，依据Bregma点为原点，测量目标脑区相对于Bregma与Lambda的前后、左右及深度坐标。根据设定参数，操作者将颅骨钻移动至对应位置，开孔尺寸以不影响操作为原则尽量缩小。

        钻孔过程需小心：使用钻头缓慢打磨目标部位的颅骨，当骨质变薄至出现裂缝时，使用注射针头轻轻挑破骨膜。过程中如出现出血，可用细长医用棉条吸尽。切记控制钻头深度，避免穿透后伤及脑组织。

第三部分：病毒注射

        使用PBS缓冲液清洗5μL微量注射器3～5次以去除残留物。

        装载病毒前，先吸取1μL空气，再吸入1μL稀释后的病毒液，确保药液能顺利注出。完成后在空气中测试注射器通畅性。

        将微量注射器安装至注射泵，并调整其位置使针头正对钻孔区域。以颅骨表面为基准（Z=0），缓慢下调针头，确保其进入脑区的深度符合预先设定坐标。针尖应始终保持垂直，注射位置须与钻孔点完全对齐。

大、小鼠脑立体定位注射图谱

 

06 肌肉注射

 

1. 在进行注射前，需对实验动物进行适当固定，确保其中一侧后肢自由且稳定，以利于顺利注射。为避免动物在操作过程中挣扎导致注射针伤及肌肉，建议由两人协作完成固定操作。具体固定方式可参照文献 “Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats”。
2. 注射时，针头应垂直进入皮肤，选择适配尺寸的注射器与针具。将针头以接近针斜面的角度插入动物股四头肌（位于大腿前侧）或大腿外侧肌肉团，缓慢注入药物。应避免注射至后腿肌群，以免损伤坐骨神经。
3. 若需进行多次肌肉注射，应交替左右腿注射，以降低局部组织损伤的风险。

 

07 皮下注射

 

1. 对实验动物进行限制时，应确保动作稳固但不过于紧迫，以便皮肤可自由移动，利于后续注射操作。
2. 若皮下注射后动物需进行常规处理操作，建议避开颈背区域，改选背部臀区或侧腹部进行注射。如需进行多次皮下注射，应轮换注射部位，以避免局部组织刺激或损伤。
3. 抓住目标部位的皮肤，轻轻向上提拉，使其形成类似“帐篷”的结构，便于针头插入。
4. 选择合适规格的注射器与针头，将针以30°至45°角插入被提起的皮肤皱褶中。注射时应与提皮的手指方向平行，并尽量远离手指，以确保操作安全。
5. 若注射成功，注射部位皮下会出现明显隆起的小肿块。操作完成后，可轻压注射点片刻，以防止药液回流。

 

08 皮内注射

 

1. 对于皮内注射，通常将动物剃毛以便可以看到皮肤；
2. 用于多次皮内注射的动物的约束可能是困难的。在这种情况下，化学镇静可能是必要的；
3. 将适当大小的针头以15-30°的角度插入皮肤。针头不要插入很远，注射遇到阻力即可。另一种方法是在注射部位附近轻轻捏住皮肤，并以非常小的角度插入针头。这在小鼠中很有用，因为它可以防止它们在注射过程中移动；
4. 如果注射成功，将会看到一个小疱。它会比周围的皮肤更苍白；
5. 注射后，轻轻施加压力以防止回流。

 

09 灌胃

 

1. 胃内灌注应仅在清醒状态下进行，避免对麻醉或镇静状态下的动物操作，以降低误吸风险。
2. 选用尺寸合适的球头口服灌胃针。该类针具末端为圆球状，可有效防止误入气管。针头所需长度可通过将动物垂直固定，从口角向下沿身体方向测量以确定。
3. 将动物垂直约束，使头部与躯干在同一直线上，有助于拉直食道，从而便于喂食针顺利通过。
4. 将球头针缓慢插入口腔，置于舌面之上。当针头位于合适位置后，调整注射器方向，使其指向上方，同时轻压上颚，使动物鼻尖朝向天花板。在大鼠操作中，针头通过咽部时可能需略作方向调整。若操作中感受到明显阻力，表明进入角度或路径需重新调整。
5. 将针头缓慢送入目标深度，操作过程应顺畅无明显阻碍。若动物出现喘息、呛咳或针头推进受阻，需立即终止操作并将针头拔出，防止造成损伤或误吸。

10 鞘内注射

 

1. 首先，剃除小鼠腰背部的毛发，并使用75%酒精棉球对操作区域进行充分消毒。
2. 将小鼠引导进入棉质手套中，左手固定动物体位，确保髂脊背部充分暴露。右手持29G注射针，待小鼠安静后，准确定位髂脊位置。根据不同品系小鼠的解剖特征：ICR小鼠的L5椎间隙几乎与髂脊处于同一水平，L6椎间隙位于髂脊尾侧约3mm处；而C57BL/6小鼠的L5椎间隙距髂脊约1.5mm，L6椎间隙则约为4mm。
3. 在靠近中线的位置，以30°～45°角度将针头刺入皮肤，并沿髂脊水平向尾侧推进，插针点约为ICR小鼠后移3mm、C57BL/6小鼠后移4mm处。若L6椎间隙无法顺利进入，可适当调整进针角度，沿棘突与乳突间的沟槽轻柔向前移动针尖，直至穿入L5椎间隙，通常可将针尖推进椎管约5mm深。
4. 针头进入椎管后，注入10μL药液。若观察到小鼠尾巴发生颤抖或突然甩动，表明进针准确，药液已注入椎管。

        补充说明：该操作方法成熟可靠，过程无需麻醉处理，不干扰动物的后续行为学测试，刺激程度较低，能够有效降低对实验数据的干扰。

 

11 脊神经内注射

 

1. 实验前一天，需对健康小鼠进行禁食禁水处理，为脊神经结扎术做好生理准备。
2. 实验当天，先剃除小鼠背部毛发，充分暴露皮肤表面。随后采用异氟烷吸入麻醉，待其进入稳定麻醉状态后进行下一步操作。
3. 动物麻醉完全后，先使用碘伏进行初步消毒，再用75%酒精棉球二次清洁。选取髂脊中线偏左约1cm处作为切口位置，使用11号手术刀片纵切皮肤，切口长度约为1cm。
4. 紧接着，在腰背部中线略偏外侧处继续分层剥离。操作时使用弯镊沿脊柱方向进行钝性分离，显露第六腰椎横突，并使用棉球清除其周围组织。随后以尖镊剪断横突，暴露出目标神经。利用玻璃电极分离出第五腰神经，用6-0丝线完成结扎。接着，采用微量注射器在神经外膜下，沿神经走向缓慢注射试剂。
5. 注射过程中应保持匀速，以避免损伤。注射完毕后，剪去多余缝线，将神经复位，再依次缝合肌肉和皮肤。术后使用碘伏进行再次消毒，确保伤口清洁。
6. 手术结束后，将小鼠安置在温暖环境中，待其自然苏醒。

        注意事项：操作过程中需持续监测小鼠呼吸频率与深度，避免因麻醉过度引发呼吸抑制或死亡等风险。

 

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