01 材料

1、实验动物

        新生24h内的SPF级SD大鼠，体质量（6.0±0.5）g，雌雄不限。

2、药品及主要试剂

        DMEM/F12（1:1）培养基和胎牛血清（FBS）、Neurobasal培养基、B27培养基添加剂、GlutaMAXsupplement（100X）、0.25 %胰酶（含EDTA、酚红）、青链霉素，小鼠抗Tau-4单克隆抗体，兔抗MAP-2多克隆抗体，小鼠抗GFAP单克隆抗体，AlexaFluor®Green488-conjugategoatanti-mouseIgG（H+L）、AlexaFluor®Red594-conjugategoatanti-rabbitIgG（H+L）、DAPI，多聚赖氨酸（PDL），MTS试剂盒。

3、主要仪器

        恒温CO₂细胞培养箱，超净工作台，倒置显微镜，荧光倒置显微镜，酶标仪，台式低温离心机。

4、主要溶液的配制

        （1）D-hanks液（1L）：KCl 0.4g、NaCl 8.0g、Na₂HPO₄·12H₂O 0.132g、KH₂PO₄ 0.06g、NaHCO₃ 0.35g，分别称取以上各种药品溶于1L ddH₂O中，调 pH 值为 7.0～7.2，无菌滤膜过滤，101.3kPa，120℃高压灭菌20min，储存于4℃冰箱备用。

        （2）多聚赖氨酸（PDL）溶液：PDL粉末用D-hanks液配成0.1mg/mL浓度，无菌滤膜过滤。

        （3） 完全培养基配制（100mL）：DMEM/F12（1:1）培养基 89% FBS 10%，青链霉素 1%。

        （4）维持培养基配制（100mL）：Neurobasal Media 96%、B27 2%、青链霉素 1%、GlutaMAX 1%。

 

02 方法

1、 细胞培养板的预处理 

        12 孔塑料培养板放入细胞爬片，用 0.1mg/mL 浓度的 PDL 包被细胞爬片 1h 或 4°C 包被过夜，用前用灭菌好的ddH₂O 漂洗 3 次，D-hanks 溶液漂洗 1 次，超净台干后，备用。

2、细胞培养

        （1）取材：取出生24h内的SD大鼠经75 %乙醇浸泡、消毒，直接断头取脑于D-hanks平皿中，冰上剪开脑皮和脊髓，钝性分离出脑组织，完毕后取出“月牙形”海马组织，仔细去除脑膜、血细胞，快速将组织块剪成1mm×1mm×1mm大小。

        （2）消化和单细胞悬液配置0.25%胰蛋白酶，37℃孵育10min，每间隔5min轻摇培养皿一次，脑组织块变圆、边缘毛刺、组织松软即终止消化，用完全培养基终止消化，吸出胰酶液，离心沉淀，200g离心5min，用Neurobasal无血清维持培养基，制成单细胞悬液。

        （3）细胞计数：0.4%台盼蓝染计数法，计细胞数。将稀释后的细胞悬液滴于血细胞计数板的计数池中，在400倍镜下计数四个中方格内的总细胞，观察并区分活细胞和死细胞。计算公式如下：细胞密度（个/mL）=四个大格的细胞数×4×10⁴×稀释倍数。

        （4）细胞接种：调整细胞悬液密度为3.5×10⁴个/mL，用移液器将单细胞悬液接种到12孔细胞培养板中，每孔2mL，37℃，放入饱和湿度和5%CO₂细胞培养箱中进行细胞培养。

        （5）细胞换液：提前将维持培养液（Neurobasal 96%、B27 2%、GluMAx1%、青链霉素 1%）预热至37℃，细胞培养24h后，弃去原培养液，加入维持培养基继续培养。此后每3d换液维持培养。

3、神经元形态学观察

        倒置显微镜观察海马神经元在不同时段的形态学变化并拍照，比较不同阶段的形态和突触形成。

图1 原代大鼠海马神经元在不同时间的细胞生长状态( × 200，比例尺= 50μm，n = 3)

4、神经元细胞活性检测
        神经细胞活性检测采用MTS法，使用酶标仪在490nm波长下测光密度（OD值），OD值越高说明细胞活性越强。将10μL的MTS检测试剂加入到96孔板中，测定1、2、3、4……12d的神经细胞活性神经细胞活性。用酶标仪检测波长在490nm的吸光度值（OD值)，OD值越高说明细胞活性越大。实验需重复3次，取5组孔，以OD值为纵坐标绘制海马神经元生长曲线。

图2 海马神经元生长曲线图( n = 3，N = 5）

 

5、神经元纯度的鉴定

        神经元培养第3d后弃培养液，将细胞用室温固定15min后以1% TritonX-100（PBS稀释）渗透15min后5% BSA封闭1h后滴加鼠抗β-III-tubulin（1:500稀释）或兔抗MAP-2抗体（1:500稀释），在4°C孵育一整夜。用PBS清洗后，滴加相应二抗（1:200稀释）37°C孵育1h（兔抗体用羊抗兔IgG，鼠抗体用羊抗鼠IgG）洗涤后，DAPI复染5min，PBS洗涤3次，避光封片后于荧光显微镜下观察。重复步骤同样进行GFAP抗体免疫荧光检测，检测胶质细胞污染情况。随机拍摄5个视野，计算神经元阳性细胞率。

图3 海马神经元的鉴定（×100，Scale bar=50μm，n=3）

 

03 心得与经验

        1、实验选取出生24h内新生鼠，可以不伤害孕鼠，节约资源，简便经济。且新生24h内新生鼠的脑组织方便固定，容易取材。

        2、控制温度和时间：整个取材过程需要在冰袋上进行，并且所取海马组织置于冷的D-hanks液中，降低细胞代谢率，维持细胞充分的活力；同时取材过程速度要快，每只新生鼠操作时间控制在3～5min，总的时间控制在60min内，以防操作时间过长造成神经元失去活力甚至死亡。

        3、剪碎海马组织时，需将其尽量快速剪碎呈1mm×1mm×1mm大小，以减少胰酶消化的时间。

        4、胰酶消化组织时，注意控制胰酶的浓度和消化时间，将其放入37℃培养箱，先消化10min，轻轻摇晃组织，使其充分消化，然后弃掉胰酶，再加入新鲜的胰酶消化5min，以缩短胰酶消化时间并减少胰酶对细胞的损伤。

        5、机械分离时注意吹打的力度和次数，尽量减少机械吹打对细胞造成的损伤，同时应尽量制成单细胞悬液，减少离心时间和转速。

        6、神经元为贴壁培养细胞，必须粘附于固相表面才能生存，多聚赖氨酸包括左旋多聚赖氨酸(PLL)和右旋多聚赖氨酸(PDL)，而PLL会损伤细胞，因此我们采用分子量为7～15万的PDL，包被细胞爬片和培养皿，以增加海马神经元的贴壁率。

        7、接种前：充分混匀细胞，先接种200μL细胞悬液；接种后：放入培养箱培养3h后，每孔补加800μL无血清培养基继续培养。此方法既可以减少接种细胞液的用量，又可以缩短细胞至玻片的距离，使细胞更容易贴壁。

        8、整个培养过程均采用无血清培养方法，未使用阿糖胞苷或5-氟尿嘧啶脱氧核苷，避免对神经元造成损伤。我们所用的Neurobasal无血清培养基为神经元专有培养，另外添加B27神经生长因子，可以选择性促进神经元生长，而抑制胶质细胞生长。

 

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