概述

        神经元细胞的体外培养一般取材于胚胎动物神经组织或新生动物脑组织，取材部位为中枢神经系统的皮质组织或周围神经的神经节。神经元细胞培养需要极高的营养条件，培养皿也需要经过特殊的处理，胶原、多聚L-赖氨酸(poly-L-lysine)有利于神经元细胞的生长，神经生长因子(NGF)、有丝分裂抑制剂(阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶)可以防止非神经元细胞的生长，促进神经元细胞的生长。

用品

        (1)新生大鼠脑组织。

        (2)培养基:一般以DMEM与F12混合培养基(1:1)作为基础培养基。培养基中可添加谷氨酰胺5mmol/L、Hepes10mmol/L、NaHCO₃ 2.2L、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、葡萄糖30mmol/L、胰岛素100mU/L、热灭活胎牛血清10%。

        (3)消化液:Ⅱ型胰蛋白酶(0.025%胰蛋白酶溶于 HBSS)。

        (4)Hanks平衡盐溶液，其中加入牛血清白蛋白 3g/L。

        (5)聚L-赖氨酸(分子量大于300000)、硅胶(Aquasil Pierce 42799)阿糖胞苷。

        (6)12mL、50mL试管、手术器械、水浴箱、3.5cm培养皿、Pasteur滴管、10mL 移液器。

步骤

        (1)硅化Pasteur滴管：用去离子蒸馏水稀释硅胶液，使浓度达0.1%~1%，将滴管浸入该溶液，或用溶液冲洗内面空气干燥24h或100℃干燥数分钟,消毒。

        (2)聚L-赖氨酸处理培养皿：用蒸馏水溶解聚L-赖氨酸(10mg/L)，过滤除菌，在每个3.5cm培养皿中加入1mL静置10~15min后除去溶液，加入适量培养液，将培养皿放入培养箱至少2h，接种细胞。

        (3)无菌条件下取新生至1d大鼠，断头处死取出大脑皮层，剪至0.5mm³碎块。

        (4)将脑碎块移入12mL试管，用HBSS液洗涤3次，每次洗涤后使组织块沉降到底，弃除洗涤液。

        (5)加入0.025%胰蛋白酶，于37℃下水浴箱中消化10~15 min。

        (6)将胰蛋白酶消化液移入50mL试管，再加入20mL完全培养液终止消化。

        (7)将上述混悬液通过硅化的巴氏滴管，充分捣碎组织，至得到单细胞悬液为止；也可采用逐步胰蛋白酶消化法、尼龙筛过滤法获得单细胞悬液。

        (8)静置3~5min，组织块沉降至试管底后用巴氏滴管将其除去，离心500r/min，5 min，弃上清。

        (9)用培养液重新悬浮细胞，接种于3.5cm培养皿，每皿接种(2.5~3.0)x10⁶/mL。置37℃、5%CO₂，孵箱中培养48h，全量换液并加入5μmol/L阿糖胞苷抑制非神经元的增殖，此后每2d半量换液。

操作提示

        神经元细胞培养需要极高的营养条件，注意在培养液中需加入高浓度的葡萄糖，有利于神经元细胞的生长。

        如需维持神经元细胞较长时间的生长，可将盖玻片放在单层神经胶质细胞支持物上进行培养。

结果及鉴定

        体外培养单纯的神经元细胞在6~7d内胞体饱满且轴突较清晰，胞体较大，有较明显的细胞核，胞质较透亮，在10~12 d后开始发生自然死亡，很难传代培养。

        神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色，用DAB等显色时，绝大部分细胞胞体及轴突呈棕黄色阳性染色。