一、概述

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。它们起源于中胚层，能够在特定条件下分化为多种类型的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等。MSCs具有多种治疗功能，包括免疫调节、抗炎、促进血管生成、抗氧化和抗细胞凋亡等。 此外，MSCs的衍生物，如外泌体，也在肿瘤治疗和炎症性皮肤病治疗中展现出巨大潜力。外泌体可以调节肿瘤增殖、凋亡、血管生成、肿瘤干细胞活性、肿瘤侵袭和转移以及肿瘤免疫。

二、实验方法

骨髓间充质干细胞分离培养

1、取材：通常使用大鼠或小鼠的股骨和胫骨作为细胞来源。首先，动物被处死并进行消毒处理，然后取出骨头并清除周围的肌肉和结缔组织。

2、骨髓冲洗：剪开骨头两端，暴露出骨髓腔，使用注射器吸取DMEM培养基从开口处注入骨髓腔，收集骨髓细胞。

3、培养：将分离出的细胞悬液接种到培养瓶中，并在37°C、5% CO2的条件下培养。

4、换液和传代：第二天更换培养基以去除未贴壁的细胞。随后，每2-3天观察细胞生长情况并更换培养基。当细胞生长到80%-90%的融合度时，使用0.25%胰蛋白酶进行消化并进行传代。

5、细胞鉴定：通过流式细胞术检测细胞表面标记物，如CD29、CD44、CD90（阳性标记）和CD34、CD45、HLA-DR（阴性标记）来鉴定BMSCs。

6、诱导分化：为了研究BMSCs的多向分化潜能，可以进行成骨、成脂和成软骨等诱导分化实验，并通过特定的染色方法（如茜素红、油红O、阿利新蓝）来鉴定分化结果。

脂肪间充质干细胞分离培养

1、取材：选用四周龄大鼠或小鼠，剪开其下腹至颈部皮肤，分离出暴露出来的腹股沟脂肪组织。

2、清洗处理：分离出的脂肪组织放入PBS洗去血污及毛发，转移入培养皿，将其剪碎转移至15mL离心管。

3、消化处理：加入10倍组织体积量的，0.1% 的I型胶原酶，放置培养箱中，37°C消化约50min。

4、离心收集：消化完成以后，1000r/min，离心5min收集细胞，加入DMEM完全培养基重悬，过200目细胞筛，制备单细胞悬液，转入培养瓶中，在37°C、5% CO2的条件下培养。

5、换液和传代：第二天更换培养基以去除未贴壁的细胞。随后，每2-3天观察细胞生长情况并更换培养基。当细胞生长到80%-90%的融合度时，使用0.25%胰蛋白酶进行消化并进行传代。

注意事项：一般做成骨成脂肪诱导可等细胞P3代，细胞纯度相对高，原代细胞细胞传代次数有限，间充质干细胞一般于6代后增殖速度明显放慢。