一、概述

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种常用的抗代谢化疗药物，主要用于治疗多种癌症，包括肠癌、胃癌、乳腺癌和头颈部癌症等。然而，肿瘤细胞可能会通过多种机制发展出对5-FU的耐药性，构建5-FU耐药株的过程中，可能会涉及到多种耐药机制的激活。包括药物代谢酶的过表达、药物靶点的改变、细胞凋亡途径的抑制等。通过研究这些耐药株，可以更好地理解肿瘤细胞对5-FU耐药的分子机制，并为开发新的治疗策略提供重要信息。

二、实验材料

PBS溶液、实验所需细胞株、5-氟尿嘧啶（5-FU）、细胞培养相关耗材

三、实验方法

1、选择亲本细胞系：选择一个对5-FU敏感的肿瘤细胞系作为起始材料。

2、初始药物暴露：将亲本细胞系接种到含有低浓度5-FU的培养基中。初始浓度应低于亲本细胞的半数抑制浓度（IC50）。

3、逐步增加药物浓度：当细胞在初始浓度下生长稳定后，逐渐增加5-FU的浓度。每次增加的幅度应适中，以确保细胞能够适应。

4、传代培养：在每次增加药物浓度后，将存活的细胞传代到新的含有相同浓度5-FU的培养基中。

5、筛选和克隆：随着药物浓度的增加，部分细胞可能会通过遗传或表观遗传变化获得耐药性。通过限制稀释法或单细胞克隆技术，从耐药细胞群体中筛选出单个耐药克隆。

6、耐药性的确认：使用MTT、MTS、克隆形成实验或流式细胞术等方法，评估耐药克隆对5-FU的敏感性。

7、分子机制研究：通过分子生物学技术，如PCR、Western blot、RNA测序等，研究耐药克隆的耐药机制。

8、基因表达分析：分析耐药株与亲本细胞系之间的基因表达差异，以确定耐药相关基因。

9、稳定性测试：将耐药克隆在无药物的培养基中培养几代，以测试耐药性的稳定性。

10、保存耐药株：将确认的耐药克隆冻存于液氮中，以备后续实验使用。

注意事项：定期检测耐药性，以确保耐药株的稳定性。记录细胞的生长特性和耐药性变化，以便及时调整实验条件。