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培养细胞的纯化

[ 时间:2024-06-07 阅读:53次 ]

细胞的纯化方法一般分为两大类,自然纯化和人工纯化。可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的而选择采用。本节主要仅介绍一些基本的方法,如要纯化特殊细胞请见其他章节。

1.自然纯化

多种细胞混杂在一起培养时,某一种细胞对体外环境适应性强,增殖较快,成为优势生长细胞群,而其他种类的细胞所占比率则越来越少,最终消失。自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势,去除其他细胞,达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法人为地选择细胞,且时间长,优势增殖的往往是成纤维细胞。部分恶性肿瘤细胞可以通过此方法,自然纯化而建立细胞系。

2. 人工纯化

利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件,抑制其他细胞的生长,从而达到纯化细胞的目的。下面介绍几种原代培养细胞纯化常用基本方法。

2.1酶消化法

概述

由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,在消化培养细胞时,常是成纤维细胞先脱壁,而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁,特别是在原代培养和培养早期的细胞这种差别尤为明显。因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。

用品

与消化法传代的用品相同。

步骤

(1) 采用普通消化传代方法,将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶内2次,每次加1mL(25cm'培养瓶),稍加摇动让胰蛋白酶流过所有细胞表面,然后倒掉。

(2) 盖好瓶盖,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现纤维样细胞变圆,部分脱壁,立即加入2m含血清培养液终止消化。

(3) 用弯头吸管轻轻吹打纤维样细胞生长的区域(可事先在显微镜下用记号笔在培养瓶上划出记号)。吹打过程中不要用力,尽可能不要吹上皮细胞生长区域,吹打结束后,再用少量培养液漂洗1遍,然后加入适量培养液继续培养,也可重复上述操作1次,或隔几日后或下次传代时,再进行上述操作。经过几次处理可能将成纤维细胞去除或将两者分开。但是,这种方法仍难以完全清除成纤维细胞。

    为了保证细胞纯化效果,可以采用选择性消化方法。显微镜下选择孤立的上皮细胞克隆,在培养皿上做好标记,吸弃培养上清液,使用灭菌的直径5mm不锈钢管,在钢管一端涂上硅脂,套在标记好的上皮细胞克隆,在管内注入消化液,获取消化的上皮细胞悬液,然后,转移到微孔培养板中,逐步扩大培养,从而建立纯化的细胞系。

2.2机械刮除法

概述

原代培养成功后,上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现并混杂生长。这种混杂生长常常分区或呈片状,每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在培养瓶底壁上。因此,可以采用机械的方法去除不需要的细胞的区域,而保留需要的。

用品

(1)橡皮细胞刮子(有成品出售,也可自制楔形的橡胶刮子,大小可根据需要而定)。

(2)细胞传代用品。

步骤

(1)将要待纯化细胞的培养瓶,放在倒置显微镜观察下进行,在瓶壁上标记好欲保留的细胞群。

(2)用上述工具在生长有不需要细胞的区域推刮,使细胞脱壁悬浮在培养液中,注意不要伤及所需细胞。

(3)推刮后用培养液冲洗2次,即可加培养液继续培养。

(4)数日后如发现不需要的细胞又长出,可再进行上述操作,这样反复多次可以纯化细胞。操作过程要严格无菌操作防止污染。

2.3 反复贴壁法

概述

成纤维细胞与上皮细胞相比,其贴壁过程快,大部分细胞常能在短时间内(大约10~30min)完成附着过程(但不一定完全伸展);而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定,稍加振荡即浮起,这样可以利用此差别来纯化细胞。

用品

与消化法传代的用品相同。

步骤

(1)将细胞悬液接种1个培养瓶内最好用无血清培养,因为在无血清支持下,上皮细胞贴壁更慢)静止20min。

(2)在镜下观察,见细胞部分贴壁、稍加摇荡也不浮起时,将培养液连同尚未贴壁细胞一起倒出或吸到另一培养瓶。

(3)继续培养或重复上述操作,将上皮细胞和成纤维细胞逐步分离开。

2.4 克隆法

在同一细胞系中,存在生物学特性不完全相同的亚群,他们的功能和生长特点略有差异。要纯化出某一种细胞,用上述方法常不能将同一细胞系的不同株分开,可采用细胞克隆的方法。

具体过程即采用细胞克隆法或有限稀释法(详见后面相关章节)将细胞分成单个细胞,使之分别生长成克隆,然后对每一克隆进行测试,选择出所需要的克隆。

2.5 培养基限定方法

某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质,否则将无法生长。而其他细胞与之相反,可以利用这种技术来纯化细胞。如转基因和杂交瘤技术中常用的C418及HAT限定性培养基或条件性养液等,就用来筛选转基因或杂交瘤细胞中阳性细胞,而抑制其他细胞(详见后面相关章节)。

2.6 流式细胞仪分离法

流式细胞仪可根据细胞大小、细胞表面标志物等参数来将细胞分离成不同的群体(详见后面相关章节)。

随着细胞生物学和相关技术的发展:近年来出现了免疫磁珠分离法,梯度分离法等细胞分离纯化方法等。


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