概述

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长但贴附不牢固的细胞也可用直接吹打传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

用品

（1）0.25%胰蛋白酶或其他消化液、培养液、Hanks 液。

（2）吸管、离心管、培养瓶（皿）、培养瓶盖、注射器、计数板、橡皮乳头。

步骤

（1）贴壁细胞的消化法传代：

①吸除或倒掉瓶内旧培养液，必要时可用Hanks液或PBS轻轻漂洗2～3次。

②以25 cm²培养瓶为例，向瓶内加入1mL消化液（胰蛋白酶或与EDTA 混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留0.2～0.4ml消化液。也可不采用上述步骤，直接加1～2ml消化液进行消化，但要注意尽量减少消化液的剩余量，因为消化液过多对细胞有损伤，同时也需较多的含血清培养液去抑制胰蛋白酶的活性。

③消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行，消化2～5min 后把培养瓶放倒置显微镜下进行观察，发现胞突回缩、细胞间隙增大以及细胞已经从培养瓶底分离为单个或成团细胞后，应立即加入适量的含血清培养液终止消化。

④如仅用胰蛋白酶可直接加含血清的培养液，终止消化。

⑤用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。

⑥计数，分别接种在新的培养瓶内，根据培养细胞类型的不同，接种比例一般多为 1:3。

（2）悬浮细胞的传代：因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。

悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800~1000r/min离心5min，然后去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，如有必要可计数，然后传代接种。

部分贴壁生长细胞，不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，导致较大数量的细胞丢失，因此绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。

操作提示

对于贴壁细胞传代培养，通常采用0.25%胰蛋白酶很容易使细胞脱离瓶壁但是，对于上皮组织来源的细胞需要采用消化作用更强的消化液，常用0.01EDTA-0.125%胰蛋白酶混合消化液。使用含EDTA的消化液，务必进行离心洗涤细胞，除净EDTA，否则，影响细胞贴壁和生长。吹打时动作要轻柔不要用力过猛同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。细胞传代比例依细胞生长速度而定，通常正常细胞传代比例为1:2~1:3肿瘤细胞1:5~1:10。细胞传代间隔时间要相对稳定，不要忽长忽短，以免影响培养细胞的生物学性状。